Analyser av proteinuri, renal infiltrasjon av leukocytter og nyreavsetning av proteiner i lupusutsatt MRL/lpr-mus

Summary

Den nåværende protokollen beskriver en metode for å spore lupusprogresjon hos mus. Ytterligere to prosedyrer presenteres for å karakterisere lupus nefritt basert på celleinfiltrasjon og proteinavsetning i nyrene.

Abstract

Systemisk lupus erythematosus (SLE) er en autoimmun lidelse uten kjent kur og er preget av vedvarende betennelse i mange organer, inkludert nyrene. Under slike omstendigheter mister nyrene sin evne til å rense avfall fra blodet og regulere salt- og væskekonsentrasjoner, noe som til slutt fører til nyresvikt. Kvinner, spesielt de i fertil alder, diagnostiseres ni ganger oftere enn menn. Nyresykdom er den viktigste årsaken til dødelighet hos SLE-pasienter. Denne protokollen beskriver en rask og enkel metode for å måle utskilte proteinnivåer i innsamlet urin, og spore lupusprogresjon over tid. I tillegg er en tilnærming til å isolere mononukleære nyreceller gitt basert på størrelse og tetthetsvalg for å undersøke nyreinfiltrasjon av leukocytter. Videre er det utviklet en immunhistokjemisk metode for å karakterisere proteinavsetning i glomeruli- og leukocyttinfiltrasjon i tubulointerstitiell plass. Sammen kan disse metodene bidra til å undersøke utviklingen av kronisk betennelse assosiert med nyrene til lupus-utsatte MRL / lpr-mus.

Introduction

Nyrenes primære funksjon er eliminering av giftige stoffer gjennom urin samtidig som homeostase av vann og^salter opprettholdes. Denne funksjonen er truet hos pasienter med systemisk lupus erythematosus (SLE), som fører til såkalt lupus nefritt (LN). LN er en konsekvens av at immunsystemet angriper nyrene, noe som fører til vedvarende nyrebetennelse, og mister derfor evnen til å rense avfall fra blodet og regulere salt- og væskekonsentrasjoner. Dette vil til slutt føre til nyresvikt, noe som kan være dødelig. Under den nefritiske prosessen rekrutteres sirkulerende B-celler, T-celler og monocytter til nyrene, utskiller kjemokiner, cytokiner og immunkompleksdannende autoantistoffer. Dette resulterer til slutt i endotelcelleskade, membranøse skader, nyretubulær atrofi og fibrose².

MRL/Mp-Fas lpr (MRL/^lpr) lupusutsatte mus er en klassisk musemodell som viser lupuslignende kliniske tegn som ligner menneskelig SLE³. Denne modellen har vært medvirkende til å forstå en av de viktigste årsakene til dødelighet hos SLE-pasienter, lupus nefritt (LN)⁴. I både human og mus SLE er LN preget av gradvis betennelse utløst av nyreavsetning av immunkomplekser, etterfulgt av komplementaktivering, rekruttering av inflammatoriske celler og tap av nyrefunksjon⁵. Immunkompleksavsetningen er det første skrittet for å indusere kjemokin- og cytokinproduksjon av inneboende nyreceller, som utvider den inflammatoriske responsen ved å rekruttere immunceller⁶. Den nåværende protokollen presenterer flere teknikker for å følge nyresykdomsprogresjon som analyserer celleinfiltrasjon og immunkompleksavsetning.

Urin samlet hver uke muliggjør deteksjon og visualisering av tidsforløpet av proteinuri før, under og etter lupusutbrudd. Proteinuri som biomarkør kan bestemme den biologiske progresjonen av LN. Andre fordeler med denne teknikken er at den er ikke-invasiv, kostnadseffektiv og enkel å implementere⁷. Når nyrene fungerer perfekt, er proteinurinivået konsekvent lavt; Hos MRL/LPR-mus, etter 8-9 ukers alder, observeres imidlertid en gradvis økning av proteinurinivået, som til slutt er høyt nok til å forårsake nyresvikt⁸. Flere reagensstrimler og kolorimetriske reagenser er kommersielt tilgjengelige for å overvåke problemet. Bradford-analysen er imidlertid billig og svært nøyaktig for å bestemme utbruddet av proteinuri og løpet av lupus nephritis. Denne analysen er rask, og reagenset påvirkes ikke av tilstedeværelsen av løsningsmidler, buffere, reduksjonsmidler og metallchelaterende midler som kan være i prøven 9,10,11.

Et viktig aspekt å vurdere er celleinfiltrasjon i nyrene. Disse infiltratratene fremmer patogenesen ved å utløse sekresjon av oppløselige faktorer som cytokiner for å forverre betennelse¹². For bedre å forstå hvilke cellepopulasjoner som er tilstede i infiltratene, er en nyttig metode å isolere leukocytter¹³. Her brukes deteksjon av nyreinfiltrasjon av B-celler som et eksempel. Prosedyren begynner med en fordøyelsesprosess med deoksyribonuklease (DNase) og kollagenase, etterfulgt av tetthetsgradientseparasjon som fjerner rusk, røde blodlegemer og tette granulocytter. Årsaken til å isolere B-celler (CD19+) og plasmaceller (CD138⁺) er at lupus nyrer kan konsentrere disse cellene¹⁴. Det foreslås at tilstedeværelsen av B-celler i små aggregater i nyrene kan indikere klonal ekspansjon og følgelig immunoglobulin (Ig) produksjon. Plasmaceller er velkjente for å være til stede i disse aggregatene også¹⁵. Når leukocytter er isolert, kan fluorescensaktivert cellesortering (FACS) brukes til å analysere cellene av interesse ved farging med forskjellige fluorescenskonjugerte antistoffer.

Immunfluorescens er en av immunhistokjemi (IHC) deteksjonsmetoder som muliggjør fluorescerende visualisering av proteiner i 4 μm tykke nyrevevsprøver. Andre IHC-deteksjonsmetoder avhenger av arten av analytter, bindingskjemi og andre faktorer¹⁶. Immunfluorescens er en rask identifikasjonsmetode som utsetter antigenet for dets motpartsantistoff merket med et spesifikt fluorokrom (eller et fluorescerende fargestoff). Når den er opphisset, produserer den lys som et fluorescensmikroskop kan oppdage. Denne teknikken kan brukes til å observere avsetningen av komplement C3 og IgG2a¹⁷. Overdreven komplementkaskadeaktivering kan være forbundet med en ukontrollert immunrespons og tap av funksjon¹⁸. Immunavsetning av anti-dobbeltstrenget DNA (anti-dsDNA) autoantistoffer i nyrene er en stor bekymring¹⁹, hvor de med IgG2a isotype har vært assosiert med LN²⁰. Spesielt viser anti-dsDNA-antistoffer mer patogenitet og affinitet til nukleære materialer, og danner immunkomplekser²¹. Når IgG2a er tilstede, aktiveres komplementkaskaden, inkludert C3, for å fjerne immunkompleksene²². C3- og IgG2a-markørene kan kvantifiseres individuelt eller overlappes for å fastslå korrelasjonen.

Spesielt er serumkreatininmåling en annen pålitelig teknikk som kan brukes sammen med mikroskopisk hematuri og nyrebiopsier for å diagnostisere LN²³. Tilstedeværelsen av proteinuri er imidlertid en sterk indikator på glomerulær skade. I den forstand kan overvåking av proteinurinivået under lupus oppdage sykdomsutbrudd og utfylle andre metoder for å diagnostisere lupus. I tillegg kan immunkomplekser avsatt i glomeruli indusere en inflammatorisk respons, aktivere komplementsystemet og rekruttere flere inflammatoriske celler. Et annet bemerkelsesverdig poeng med denne protokollen er B-celleinfiltrasjon i nyrene. Dette, sammen med de infiltrerte T-cellene, forsterker lokale immunresponser som utløser organskade. Det er viktig at klassifiseringen av LN ikke bare er basert på glomerulære morfologiske endringer sett i mikroskopi, men også immunavsetninger observert med immunfluorescens. Derfor, i denne protokollen, tilbys nøyaktige og kostnadseffektive metoder for analyse av nyrefunksjon i laboratorieinnstillinger.

Protocol

Denne protokollen er godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved Virginia Tech. Siden lupussykdom har høyere forekomst hos kvinner, ble det kun brukt MRL/LPR-mus hos kvinner. Prøvesamlingen ble startet ved 4 ukers alder og avsluttet ved 15 uker. Musene ble hentet fra kommersielle kilder (se Materialtabell) og ble avlet og vedlikeholdt i et spesifikt patogenfritt miljø etter de institusjonelle retningslinjene. 1. Proteinuri test <ol…

Representative Results

Protokollen bruker flere metoder for å vurdere MRL / lpr mus for lupus nefritt. Først beskrives en prosedyre for å studere økte proteinurinivåer på grunn av nyresvikt over tid. Som vist i figur 1 ble hunnmus behandlet med oral gavage på 200 μL fosfatbufret saltvann (1x PBS) som kontrollgruppe og probiotisk Lactobacillus reuteri som behandlingsgruppe, i en konsentrasjon på 109 cfu/ml, to ganger i uken. Behandlingen startet ved 3 ukers alder og avsluttet ved 15 uke…

Discussion

LN er en ledende dødsårsak hos SLE-pasienter, og faktorer som forverrer sykdommen er fortsatt uklare. Anvendelsen av denne protokollen er å karakterisere nyrefunksjonen ved hjelp av flere metoder, inkludert måling av proteinuri, FACS-analyse av isolerte nyreleukocytter og immunfluorescensfarging av frosne nyreseksjoner.

Et viktig poeng å vurdere når du samler urin er at man må være konsistent med tidspunktet på dagen og plasseringen av urinsamlingen. Mus er nattdyr, så de mest nøyak…

Materials

10x Tris-Buffered Saline (TBS)	Thermo Fisher Scientific	J60764.K2
2-mercaptoethanol	Thermo Fisher Scientific	21985-023
Anti-Human/Mouse C3	Cedarlane	CL7632F
Anti-Mouse CD138 BV711	Biolegend	142519
Anti-Mouse CD45 AF700	Biolegend	103127
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A9418-100G
Collagenase D	Sigma-Aldrich	11088882001
Confocal Microscope LSM 880	Zeiss	LSM 880
Coplin jar	Fisher Scientific	50-212-281
Cryomold	Fisher Scientific	NC9511236
Density gradient medium	GE Healthcare	17-1440-02	Percoll
DEPC-Treated water	Thermo Fisher Scientific	AM9906
DNase I	Sigma-Aldrich	D4527
dsDNA-EC	InvivoGen	tlrl-ecdna
Ethylenediaminetetraacetic Acid	Fisher Scientific	S311-500	EDTA
EVOS M5000 Microscope imaging system	Thermo Fisher Scientific	AMF5000
FACS Fusion Cell sorter	BD Biosciences	FACS Fusion
Fetal Bovine Serum – Premium, Heat Inactivated	R&D systems	S11150H
Fisherbrand 96-Well Polystyrene Plates	Fisher Scientific	12-565-501
Graphpad prism	GraphPad	N/A
Hank’s Balanced Salt Solution	Thermo Fisher Scientific	14175-079
HEPES	Thermo Fisher Scientific	15630-080
ImageJ software	National Institutes of Health	N/A
Lactobacillus reuteri Kandler et al.	ATCC	23272
MEM non-essential amino acids	Thermo Fisher Scientific	11140-050
MRL/MpJ-Fas lpr /J Mice (MRL/lpr)	Jackson Lab	485
Nail enamel	N/A	N/A	Any conventional store
O.C.T compound	Tisse-Tek	4583
PAP pen	Sigma-Aldrich	Z377821
Peel-A-Way Disposable Embedding Molds	Polysciences	R-30
Penicillin-Streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15140-122
Phosphate-buffered saline (PBS)	Thermo Fisher Scientific	70011069
Pierce 20x TBS Buffer	Thermo Fisher Scientific	28358
Pierce Coomassie Plus (Bradford) Assay kit	Thermo Fisher Scientific	23236	Albumin standard included
ProLon Gold Antifade Mountant	ThermoFisher	P36934
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32	BD Biosciences	553141	FcR block
RPMI 1640	Thermo Fisher Scientific	11875-093
Sodium pyruvate	Thermo Fisher Scientific	11360-070
SpectraMax M5	Molecular Devices	N/A	SoftMax Pro 6.1 software
Sterile cell Strainers 100 µM	Fisher Scientific	22363549
Tween 20	Fisher Scientific	BP337-500
Vancomycin Hydrochloride	Goldbio	V-200-1
Zombie Aqua	Biolegend	423102	fluorescent dye for flow cytometry analysis