Анализ протеинурии, почечной инфильтрации лейкоцитов и почечного отложения белков у склонных к волчанке МРЛ/ЛПР мышей

Summary

Настоящий протокол описывает метод отслеживания прогрессирования волчанки у мышей. Представлены две дополнительные процедуры для характеристики волчаночного нефрита на основе клеточной инфильтрации и отложении белка в почках.

Abstract

Системная красная волчанка (СКВ) является аутоиммунным заболеванием без известного лечения и характеризуется стойким воспалением во многих органах, включая почки. При таких обстоятельствах почка теряет способность очищать отходы из крови и регулировать концентрацию соли и жидкости, что в конечном итоге приводит к почечной недостаточности. Женщины, особенно детородного возраста, диагностируются в девять раз чаще, чем мужчины. Заболевание почек является основной причиной смертности у пациентов с СКВ. Настоящий протокол описывает быстрый и простой метод измерения уровня выделяемого белка в собранной моче, отслеживая прогрессирование волчанки с течением времени. Кроме того, предусмотрен подход к выделению мононуклеарных клеток почек на основе выбора размера и плотности для исследования почечной инфильтрации лейкоцитов. Кроме того, разработан иммуногистохимический метод для характеристики отложений белка в клубочках и инфильтрации лейкоцитов в тубулоинтерстициальном пространстве. Вместе эти методы могут помочь исследовать прогрессирование хронического воспаления, связанного с почками склонных к волчанке МРЛ / лпр мышей.

Introduction

Основной функцией почек является выведение токсических веществ через мочу при сохранении гомеостаза воды и солей¹. Эта функция находится под угрозой у пациентов с системной красной волчанкой (СКВ), что приводит к так называемому волчаночному нефриту (ЛН). LN является следствием того, что иммунная система атакует почки, что приводит к постоянному воспалению почек, поэтому она теряет способность очищать отходы из крови и регулировать концентрацию соли и жидкости. Это в конечном итоге приведет к почечной недостаточности, которая может быть фатальной. Во время нефритического процесса циркулирующие В-клетки, Т-клетки и моноциты рекрутируются в почку, секретируя хемокины, цитокины и иммунные комплексообразующие аутоантитела. Это в конечном итоге приводит к повреждению эндотелиальных клеток, мембранным повреждениям, атрофии почечных канальцев и фиброзу².

MRL / Mp-Fas^lpr (MRL / lpr) мыши, склонные к волчанке, являются классической моделью мыши, проявляющей волчаноподобные клинические признаки, которые напоминают человеческую СКВ³. Эта модель сыграла важную роль в понимании одной из ведущих причин смертности у пациентов с СКВ, волчаночного нефрита (LN)⁴. Как у человека, так и у мышей СКВ LN характеризуется постепенным воспалением, вызванным почечным отложением иммунных комплексов, за которым следует активация комплемента, набор воспалительных клеток и потеря функции почек⁵. Отложение иммунного комплекса является первым шагом к индуцированию производства хемокина и цитокина внутренними почечными клетками, что расширяет воспалительный ответ путем набора иммунных клеток⁶. Текущий протокол представляет несколько методов для отслеживания прогрессирования почечной недостаточности, которые анализируют инфильтрацию клеток и отложение иммунного комплекса.

Моча, собранная каждую неделю, позволяет обнаружить и визуализировать временное течение протеинурии до, во время и после начала волчанки. Протеинурия как биомаркер может определять биологическую прогрессию ЛН. Другие преимущества этого метода заключаются в том, что он неинвазивный, экономически эффективный и простой в реализации⁷. Когда почка работает отлично, уровень протеинурии стабильно низкий; однако у мышей MRL/lpr после 8-9-недельного возраста наблюдается постепенное повышение уровня протеинурии, который в конечном итоге достаточно высок, чтобы вызвать почечную недостаточность⁸. Несколько полосок реагентов и колориметрических реагентов коммерчески доступны для мониторинга проблемы. Однако брэдфордский анализ дешев и очень точен в определении начала протеинурии и течения волчаночного нефрита. Этот анализ является быстрым, и на реагент не влияет присутствие растворителей, буферов, восстановителей и хелатирующих агентов, которые могут быть в вашем образце ^9,10,11.

Одним из важных аспектов, которые следует учитывать, является инфильтрация клеток в почках. Эти инфильтраты способствуют патогенезу, вызывая секрецию растворимых факторов, таких как цитокины, для усугубления воспаления¹². Чтобы лучше понять, какие клеточные популяции присутствуют в инфильтратах, полезным методом является выделение лейкоцитов¹³. Здесь в качестве примера используется обнаружение почечной инфильтрации В-клеток. Процедура начинается с процесса пищеварения дезоксирибонуклеазой (ДНКаза) и коллагеназой, за которым следует разделение градиента плотности, которое удаляет мусор, эритроциты и плотные гранулоциты. Причина выделения В-клеток (CD19⁺) и плазматических клеток (CD138+) заключается ^в том, что волчаночные почки могут концентрировать эти клетки¹⁴. Предполагается, что наличие В-клеток в небольших агрегатах в почках может свидетельствовать о клональной экспансии и, следовательно, выработке иммуноглобулина (Ig). Хорошо известно, что плазматические клетки присутствуют в этих агрегатах, а также¹⁵. После того, как лейкоциты были выделены, флуоресцентно-активированная клеточная сортировка (FACS) может быть использована для анализа клеток, представляющих интерес, при окрашивании различными флуоресцентно-конъюгированными антителами.

Иммунофлуоресценция является одним из методов иммуногистохимии (IHC), который позволяет флуоресцентную визуализацию белков в образцах почечной ткани толщиной 4 мкм. Другие методы обнаружения IHC зависят от природы аналитов, химии связывания и других факторов¹⁶. Иммунофлуоресценция — это метод быстрой идентификации, который подвергает антиген воздействию его аналога антитела, меченного специфическим фторхромом (или флуоресцентным красителем). При возбуждении он производит свет, который может обнаружить флуоресцентный микроскоп. Этот метод может быть использован для наблюдения осаждения комплемента C3 и IgG2a¹⁷. Чрезмерная каскадная активация комплемента может быть связана с неконтролируемым иммунным ответом и потерей функции¹⁸. Иммунная депонирование антидвухлопчатых аутоантител ДНК (анти-dsDNA) в почках является основной проблемой¹⁹, где те, у кого изотип IgG2a, были связаны с LN²⁰. В частности, анти-dsDNA антитела проявляют большую патогенность и сродство к ядерным материалам, образуя иммунные комплексы²¹. Когда присутствует IgG2a, каскад комплемента, включая C3, активируется для очистки иммунных комплексов²². Маркеры C3 и IgG2a могут быть количественно определены по отдельности или наложены для установления их корреляции.

Примечательно, что измерение креатинина в сыворотке крови является еще одним надежным методом, который можно использовать вместе с микроскопической гематурией и биопсией почек для диагностики LN²³. Однако наличие протеинурии является сильным показателем повреждения клубочков. В этом смысле мониторинг уровня протеинурии во время волчанки может обнаружить начало заболевания и дополнить другие методы диагностики волчанки. Кроме того, иммунные комплексы, отложенные в клубочках, могут вызывать воспалительную реакцию, активировать систему комплемента и набирать больше воспалительных клеток. Еще одним примечательным моментом этого протокола является инфильтрация В-клеток в почке. Это, вместе с инфильтрированными Т-клетками, усиливает местные иммунные реакции, которые вызывают повреждение органов. Важно отметить, что классификация LN основана не только на клубочковых морфологических изменениях, наблюдаемых в микроскопии, но и на иммунных отложениях, наблюдаемых при иммунофлуоресценции. Поэтому в данном протоколе предлагаются точные и экономически эффективные методы анализа функции почек в лабораторных условиях.

Protocol

Настоящий протокол одобрен Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) в Virginia Tech. Поскольку болезнь волчанки имеет более высокую заболеваемость у самок, использовались только самки мышей MRL / lpr. Отбор проб начинался в возрасте 4 недель и заканчивался в 15 не?…

Representative Results

Протокол использует несколько методов для оценки МРЛ/лпр мышей на волчаночный нефрит. Во-первых, описана процедура изучения повышенного уровня протеинурии из-за дисфункции почек с течением времени. Как показано на рисунке 1, самок мышей лечили пероральным приемом 200 мкл…

Discussion

ЛН является основной причиной смертности у пациентов с СКВ, и факторы, усугубляющие заболевание, остаются неясными. Применение этого протокола заключается в характеристике функции почек с использованием нескольких методов, включая измерение протеинурии, анализ FACS изолированных лейк?…

Materials

10x Tris-Buffered Saline (TBS)	Thermo Fisher Scientific	J60764.K2
2-mercaptoethanol	Thermo Fisher Scientific	21985-023
Anti-Human/Mouse C3	Cedarlane	CL7632F
Anti-Mouse CD138 BV711	Biolegend	142519
Anti-Mouse CD45 AF700	Biolegend	103127
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A9418-100G
Collagenase D	Sigma-Aldrich	11088882001
Confocal Microscope LSM 880	Zeiss	LSM 880
Coplin jar	Fisher Scientific	50-212-281
Cryomold	Fisher Scientific	NC9511236
Density gradient medium	GE Healthcare	17-1440-02	Percoll
DEPC-Treated water	Thermo Fisher Scientific	AM9906
DNase I	Sigma-Aldrich	D4527
dsDNA-EC	InvivoGen	tlrl-ecdna
Ethylenediaminetetraacetic Acid	Fisher Scientific	S311-500	EDTA
EVOS M5000 Microscope imaging system	Thermo Fisher Scientific	AMF5000
FACS Fusion Cell sorter	BD Biosciences	FACS Fusion
Fetal Bovine Serum – Premium, Heat Inactivated	R&D systems	S11150H
Fisherbrand 96-Well Polystyrene Plates	Fisher Scientific	12-565-501
Graphpad prism	GraphPad	N/A
Hank’s Balanced Salt Solution	Thermo Fisher Scientific	14175-079
HEPES	Thermo Fisher Scientific	15630-080
ImageJ software	National Institutes of Health	N/A
Lactobacillus reuteri Kandler et al.	ATCC	23272
MEM non-essential amino acids	Thermo Fisher Scientific	11140-050
MRL/MpJ-Fas lpr /J Mice (MRL/lpr)	Jackson Lab	485
Nail enamel	N/A	N/A	Any conventional store
O.C.T compound	Tisse-Tek	4583
PAP pen	Sigma-Aldrich	Z377821
Peel-A-Way Disposable Embedding Molds	Polysciences	R-30
Penicillin-Streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15140-122
Phosphate-buffered saline (PBS)	Thermo Fisher Scientific	70011069
Pierce 20x TBS Buffer	Thermo Fisher Scientific	28358
Pierce Coomassie Plus (Bradford) Assay kit	Thermo Fisher Scientific	23236	Albumin standard included
ProLon Gold Antifade Mountant	ThermoFisher	P36934
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32	BD Biosciences	553141	FcR block
RPMI 1640	Thermo Fisher Scientific	11875-093
Sodium pyruvate	Thermo Fisher Scientific	11360-070
SpectraMax M5	Molecular Devices	N/A	SoftMax Pro 6.1 software
Sterile cell Strainers 100 µM	Fisher Scientific	22363549
Tween 20	Fisher Scientific	BP337-500
Vancomycin Hydrochloride	Goldbio	V-200-1
Zombie Aqua	Biolegend	423102	fluorescent dye for flow cytometry analysis