Augenentfernung in lebenden Zebrafischlarven zur Untersuchung des innervationsabhängigen Wachstums und der Entwicklung des visuellen Systems

Summary

Der Artikel erklärt, wie man Augen von lebenden Zebrafischlarven chirurgisch entfernt, als ersten Schritt zur Untersuchung, wie der retinale Input das Wachstum und die Entwicklung des optischen Tektums beeinflusst. Darüber hinaus enthält der Artikel Informationen über Larvenanästhesie, Fixierung und Hirndissektion, gefolgt von Immunhistochemie und konfokaler Bildgebung.

Abstract

Zebrafische weisen ein bemerkenswertes lebenslanges Wachstum und regenerative Fähigkeiten auf. Zum Beispiel unterstützen spezialisierte Stammzellnischen, die während der Embryogenese etabliert wurden, das kontinuierliche Wachstum des gesamten visuellen Systems, sowohl im Auge als auch im Gehirn. Koordiniertes Wachstum zwischen der Netzhaut und dem optischen Tectum gewährleistet eine genaue retinotopische Kartierung, wenn neue Neuronen in den Augen und im Gehirn hinzugefügt werden. Um zu untersuchen, ob retinale Axone entscheidende Informationen für die Regulierung des Verhaltens von tektalen Stamm- und Vorläuferzellen wie Überleben, Proliferation und / oder Differenzierung liefern, ist es notwendig, innervierte und denervierte tektale Lappen innerhalb desselben Tieres und zwischen Tieren vergleichen zu können.

Die chirurgische Entfernung eines Auges aus lebenden Larvenzebrafischen mit anschließender Beobachtung des optischen Tectums erreicht dieses Ziel. Das begleitende Video zeigt, wie man Larven betäubt, Wolframnadeln elektrolytisch schärft und damit ein Auge entfernt. Als nächstes wird gezeigt, wie man Gehirne aus festsitzenden Zebrafischlarven seziert. Schließlich bietet das Video einen Überblick über das Protokoll für die Immunhistochemie und eine Demonstration, wie gefärbte Embryonen in Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt für die Mikroskopie gemountet werden können.

Introduction

Ziel dieser Methode ist es zu untersuchen, wie der retinale Input das Wachstum und die Entwicklung des optischen Tektums, des visuellen Verarbeitungszentrums im Zebrafischgehirn, beeinflusst. Durch Entfernen eines Auges und anschließenden Vergleich der beiden Seiten des optischen Tektums können tektale Veränderungen innerhalb derselben Probe beobachtet und normalisiert werden, was einen Vergleich zwischen mehreren Proben ermöglicht. Moderne molekulare Ansätze in Kombination mit dieser Technik werden Einblicke in die Mechanismen liefern, die dem Wachstum und der Entwicklung des visuellen Systems sowie der axonalen Degeneration und Regeneration zugrunde liegen.

Sensorische Systeme – visuelle, auditive und somatosensorische – sammeln Informationen von externen Organen und leiten diese Informationen an das zentrale Nervensystem weiter, wodurch “Karten” der äußeren Welt im Mittelhirn erzeugt^{werden 1,2.} Das Sehen ist die dominierende sensorische Modalität für fast alle Wirbeltiere, einschließlich vieler Fische. Die Netzhaut, das Nervengewebe im Auge, sammelt Informationen mit einem neuronalen Schaltkreis, der hauptsächlich aus Photorezeptoren, bipolaren Zellen und retinalen Ganglienzellen (RGCs), den Projektionsneuronen der Netzhaut, besteht. RGCs haben lange Axone, die ihren Weg über die innere Oberfläche der Netzhaut zum Sehnervenkopf finden, wo sie faszikulieren und gemeinsam durch das Gehirn wandern und schließlich im visuellen Verarbeitungszentrum im dorsalen Mittelhirn enden. Diese Struktur wird bei Fischen und anderen Nicht-Säugetierwirbeltieren als optisches Tectum bezeichnet und ist homolog zum Colliculus superior bei Säugetieren³.

Das optische Tectum ist eine bilateral symmetrische Mehrschichtstruktur im dorsalen Mittelhirn. Bei Zebrafischen und den meisten anderen Fischen erhält jeder Lappen des optischen Tektums visuelle^Eingaben ausschließlich vom kontralateralen Auge, so dass der linke Sehnerv im rechten Tektallappen und der rechte Sehnerv im linken Tektallappen 4 endet (Abbildung 1). Wie sein Gegenstück bei Säugetieren, der Colliculus superior, integriert das optische Tectum visuelle Informationen mit anderen sensorischen Eingaben, einschließlich Vorsprechen und Somatosensation, und steuert Verschiebungen der visuellen Aufmerksamkeit und Augenbewegungen wie Sakkaden ^1,5,6. Im Gegensatz zum Colliculus superior des Säugetiers erzeugt das optische Tectum jedoch kontinuierlich neue Neuronen und Glia aus einer spezialisierten Stammzellnische in der Nähe der medialen und kaudalen Ränder der tektalen Lappen, der sogenannten tektalen Proliferationszone⁷. Die Aufrechterhaltung proliferativer Vorläufer im optischen Tectum und anderen Regionen des zentralen Nervensystems trägt zum Teil zu der bemerkenswerten Regenerationsfähigkeit bei, die in Zebrafisch⁸ dokumentiert ist.

Frühere Arbeiten, die das Gehirn von blinden oder einäugigen Fischen untersuchten, ergaben, dass die Größe des optischen Tektums direkt proportional zur Menge der retinalen Innervation ist, die sie erhält ^9,10,11. Bei erwachsenen Höhlenfischen, deren Augen in der frühen Embryogenese degenerieren, ist das optische Tectum merklich kleiner als bei eng verwandten, gesichteten Oberflächenfischen⁹. Die Degeneration der Höhlenfischaugen kann blockiert werden, indem die endogene Linse während der Embryogenese durch eine Linse von einem Oberflächenfisch ersetzt wird. Wenn diese einäugigen Höhlenfische bis ins Erwachsenenalter aufgezogen werden, enthält der innervierte Tektallappen etwa 10% mehr Zellen als der nicht innervierte Tektallappen⁹. In ähnlicher Weise war bei Larvenkillifischen, die mit chemischen Behandlungen inkubiert wurden, um Augen unterschiedlicher Größe innerhalb desselben Individuums zu erzeugen, die Seite des Tektums mit mehr Innervation größer und enthielt mehr Neuronen¹⁰. Beweise aus Experimenten zur Quetschung des Sehnervs an erwachsenen Goldfischen deuten darauf hin, dass die Innervation die Proliferation fördert, wobei die Proliferation der tektalen Zellen abnimmt, wenn die Innervation gestört ist¹¹.

Mehrere neuere Berichte, die diese klassischen Studien bestätigen und erweitern, liefern Daten, die darauf hindeuten, dass die Proliferation als Reaktion auf Innervation zumindest teilweise durch den BDNF-TrkB-Signalweg^12,13 moduliert wird. Es bleiben viele offene Fragen zum Wachstum und zur Entwicklung des optischen Tektums, einschließlich der Frage, wie ein sich entwickelndes sensorisches System mit Verletzungen und Axondegeneration fertig wird, welche zellulären und molekularen Signale es ermöglichen, dass der Netzhauteintrag das Wachstum des optischen Tektums reguliert, wann diese Mechanismen aktiv werden und ob die innervationsbedingte Proliferation und Differenzierung es der Netzhaut und ihrem Zielgewebe ermöglicht, Wachstumsraten zu koordinieren und eine genaue retinotopische Kartierung zu gewährleisten. Darüber hinaus gibt es viel größere Fragen zur aktivitätsabhängigen Entwicklung, die durch die Befragung des visuellen Systems des Zebrafisches mit chirurgischen Ansätzen wie dem unten beschriebenen beantwortet werden können.

Um die zellulären und molekularen Mechanismen zu untersuchen, durch die neuronale Aktivität, insbesondere durch visuellen Input, das Überleben und die Proliferation von Zellen verändert, vergleicht der beschriebene Ansatz direkt innervierte und denervierte tektale Lappen (Abbildung 1) innerhalb einzelner Zebrafischlarven. Diese Methode ermöglicht die Dokumentation der RGC-Axondegeneration im optischen Tectum und die Bestätigung, dass die Anzahl der mitotischen Zellen mit der Innervation korreliert.

Abbildung 1: Skizzen von Zebrafischlarven vor und nach einseitiger Augenentfernung . (A) Zeichnung von 5 dpf-Larven unter einem Seziermikroskop. Jede Larve ist in Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt eingebettet und seitlich ausgerichtet, bevor eine Wolframnadel mit einer scharfen, hakenförmigen Spitze verwendet wird, um das nach oben gerichtete Auge (in diesem Beispiel linkes Auge) herauszuholen. (B) Zeichnung der dorsalen Ansicht einer 9 dpf Larve, die aus der in A dargestellten Operation resultiert. Nur drei hochschematisierte RGC-Axone aus dem rechten Auge sind defaszikulierend und verbinden sich mit Neuronen im linken tektalen Lappen. Abkürzungen: dpf = Tage nach der Befruchtung; dps = Tage nach der Operation; RGC = retinale Ganglienzellen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Protocol

Die Methoden in diesem Papier wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien und der Genehmigung der Institutional Animal Care and Use Committees des Reed College und des University College London durchgeführt. Weitere Informationen zu den in dieser Studie verwendeten Zebrafischstämmen finden Sie in der Materialtabelle . 1. Bereiten Sie Materialien und Werkzeuge vor Machen Sie Lösungen. Machen Sie Embryo-Medium (E314</sup…

Representative Results

Um zu bestätigen, ob die Augenentfernung abgeschlossen war und um zu beurteilen, wie sich das optische Tectum verändert, wurden Operationen im Tg[atoh7:RFP]-Stamm durchgeführt, der alle RGCs mit einem membrangerichteten RFP und damit alle Axone markiert, die aus der Netzhaut ragen und den Sehnerv24 bilden. Obwohl die Verwendung dieser Belastung nicht unbedingt erforderlich ist, ermöglicht sie eine einfache Beobachtung und Visualisierung der Sehnerventermini im optischen Tectum neuropi…

Discussion

Die in diesem Artikel beschriebenen Techniken veranschaulichen einen von vielen Ansätzen zur Untersuchung der visuellen Systementwicklung von Wirbeltieren bei Zebrafischen. Andere Forscher haben Methoden veröffentlicht, um die embryonale Netzhaut zu sezieren und Genexpressionsanalysen^{durchzuführen 19} oder neuronale Aktivität im optischen Tectum³⁰ zu visualisieren. Dieses Papier bietet einen Ansatz, um zu untersuchen, wie differentieller Netzhauteintrag das Zellverhalten…

Materials

Equipment and supplies:
Breeding boxes	Aquaneering	ZHCT100
Dow Corning high vacuum grease	Sigma or equivalent supplier	Z273554
Erlenmeyer flasks (125 mL)			For making Marc's Modified Ringers (MMR) with antibiotics for post-surgery incubation
Fine forceps – Dumont #5	Fine Science Tools (FST)	11252-20
Glass Pasteur pipettes	DWK Lifescience	63A53 & 63A53WT	For pipetting embryos and larvae
Glass slides for microscopy	VWR or equivalent supplier	48311-703	Standard glass microscope slides can be ordered from many different laboratory suppliers.
Glassware including graduated bottles and graduated cylinders			For making and storing solutions
2-part epoxy resin	ACE Hardware or other equivalent supplier of Gorilla Glue or equivalent	0.85 oz syringe	https://www.acehardware.com/departments/paint-and-supplies/tape-glues-and-adhesives/glues-and-epoxy/1590793
Microcentrifuge tube (1.7 mL)	VWR or equivalent supplier	22234-046
Nickel plated pin holder (17 cm length)	Fine Science Tools (FST)	26018-17	To hold tungsten wire while sharpening and performing surgeries/dissections.
Nylon mesh tea strainer or equivalent	Ali Express or equivalent		For harvesting zebrafish eggs after spawning; https://www.aliexpress.com/item/1005002219569756.html
Paper clip			For Tungsten needle sharpening device.
Petri dishes 100 mm	Fischer Scientific or equivalent supplier	50-190-0267
Petri dishes 35 mm	Fischer Scientific or equivalent supplier	08-757-100A
Pipette pump	SP Bel-Art or equivalent	F37898-0000
Potassium hydroxide (KOH)	Sigma	909122	For Tungsten needle sharpening device. Make a 10% w/v solution of KOH in the hood by adding pellets to deionized water.
Power supply (variable voltage)			For Tungsten needle sharpening device. Any power supply with variable voltage will work (even one used for gel electrophoresis).
Sylgard 184 Elastomer kit	Dow Corning	3097358
Tungsten wire (0.125 mm diameter)	World Precision Instruments (WPI)	TGW0515	Sharpen to remove eye and dissect larvae.
Variable temperature heat block	The Lab Depot or equivalent supplier	BSH1001 or BSH1002	Set to 40-42 °C ahead of experiments.
Wide-mouth glass jar with lid (e.g., clean jam or salsa jar)			For Tungsten needle sharpening device.
Wires with alligator clip leads			For Tungsten needle sharpening device.
Microscopes:
Dissecting microscope			Any type will work but having adjustable transmitted light on a mirrored base is preferred.
Laser scanning confocal microscope			High NA, 20-25x water dipping objective lens is recommended. Microscope control and image capture software (Elements) is used here but any confocal microscope will work.
Reagents for surgeries and dissections:
Calcium chloride dihydrate	Sigma	C7902	For Marc's Modified Ringers (MMR) and embryo medium (E3).
HEPES	Sigma	H7006	For Marc's Modified Ringers (MMR).
Low melting point agarose	Invitrogen	16520-050	Make 1% in embryo medium (E3) or Marc's Modified Ringers (MMR).
Magnesium chloride hexahydrate	Sigma	1374248	For embryo medium (E3).
Magnesium sulfate	Sigma	M7506	For Marc's Modified Ringers (MMR).
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	19210	Dilute 8% (w/v) stock with 2x concentrated PBS (diluted from 10x PBS stock).
Penicillin/Streptomycin	Sigma	P4333-20ML	Dilute 1:100 in Marc's Modified Ringers.
Phosphate buffered saline (PBS) tablets	Diagnostic BioSystems	DMR E404-01	Make 10x stock in deionized water, autoclave and store at room temperature. Dilute to 1x working concentration.
Potassium chloride	Sigma	P3911	For Marc's Modified Ringers (MMR) and embryo medium (E3).
Sodium chloride	Sigma	S9888	For Marc's Modified Ringers (MMR) and embryo medium (E3).
Sodium hydroxide	Sigma	S5881	Make 10 M and use to adjust pH of MMR to 7.4.
Sucrose	Sigma	S9378
Tricaine-S	Pentair	100G #TRS1	Recipe: https://zfin.atlassian.net/wiki/spaces/prot/pages/362220023/TRICAINE
Reagents for immunohistochemistry:
Alexafluor 568 tagged Secondary antibody to detect rabbit IgG	Invitrogen	A-11011	Use at 1:500 dilution for wholemount immunohistochemistry.
DAPI or ToPro3	Invitrogen	1306 or T3605	Make up 1 mg/mL solutions in DMSO; 1:5,000 dilution for counterstaining.
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma	D8418	A component of immunoblock buffer.
Methanol (MeOH)	Sigma	34860	Mixing MeOH with aqueous solutions like PBST is exothermic. Make the MeOH/PBST solutions at least several hours ahead of time or cool them on ice before using.
Normal goat serum	ThermoFisher Scientific	50-062Z	A component of immunoblock buffer. Can be aliquoted in 1-10 mL volumes and stored at -20 °C.
Primary antibody to detect phosphohistone H3	Millipore	06-570	Use at 1:300 dilution for wholemount immunohistochemistry.
Primary antibody to detect Red Fluorescent Protein (RFP; detects dsRed derivatives)	MBL International	PM005	Use at 1:500 dilution for wholemount immunohistochemistry.
Proteinase K (PK)	Sigma	P2308-10MG	Make up 10 mg/mL stock solutions in PBS and use at 10 µg/mL.
Triton X-100	Sigma	T8787	Useful to make a 20% (v/v) stock solution in PBS.
Software for data analysis
ImageJ (Fiji)			freeware for image analysis; https://imagej.net/software/fiji/
Rstudio			freeware for statistical analysis and data visualization; https://www.rstudio.com/products/rstudio/download/
Adobe Photoshop or GIMP			Proprietary image processing software (Adobe Photoshop and Illustrator) are often used to compose figures). A freeware alternative is Gnu Image Manipulation Program (GIMP; https://www.gimp.org/)
Zebrafish strains			available from the  Zebrafish International Resource Centers in the US (https://zebrafish.org/home/guide.php) or in Europe (https://www.ezrc.kit.edu/). Specialized transgenic strains that have not yet been deposited in either resource center can be requested from individual labs after publication.