Rimozione dell'occhio nelle larve di zebrafish viventi per esaminare la crescita dipendente dall'innervazione e lo sviluppo del sistema visivo

Summary

L’articolo spiega come rimuovere chirurgicamente gli occhi dalle larve viventi di zebrafish come primo passo verso lo studio di come l’input retinico influenza la crescita e lo sviluppo del tectum ottico. Inoltre, l’articolo fornisce informazioni sull’anestesia larvale, la fissazione e la dissezione cerebrale, seguite da immunoistochimica e imaging confocale.

Abstract

I pesci zebra mostrano una notevole crescita per tutta la vita e capacità rigenerative. Ad esempio, nicchie di cellule staminali specializzate stabilite durante l’embriogenesi supportano la crescita continua dell’intero sistema visivo, sia nell’occhio che nel cervello. La crescita coordinata tra la retina e il tectum ottico garantisce un’accurata mappatura retinotopica quando vengono aggiunti nuovi neuroni negli occhi e nel cervello. Per capire se gli assoni retinici forniscono informazioni cruciali per la regolazione dei comportamenti delle cellule staminali e progenitrici del tectale come la sopravvivenza, la proliferazione e / o la differenziazione, è necessario essere in grado di confrontare i lobi tettoli innervati e denervati all’interno dello stesso animale e tra gli animali.

La rimozione chirurgica di un occhio dal pesce zebra larvale vivente seguita dall’osservazione del tectum ottico raggiunge questo obiettivo. Il video di accompagnamento dimostra come anestetizzare le larve, affilare elettroliticamente gli aghi di tungsteno e usarli per rimuovere un occhio. Successivamente mostra come sezionare il cervello dalle larve fisse di zebrafish. Infine, il video fornisce una panoramica del protocollo per l’immunoistochimica e una dimostrazione di come montare embrioni colorati in agarosio a basso punto di fusione per la microscopia.

Introduction

L’obiettivo di questo metodo è quello di indagare come l’input retinico influenza la crescita e lo sviluppo del tectum ottico, il centro di elaborazione visiva nel cervello del pesce zebra. Rimuovendo un occhio e quindi confrontando i due lati del tectum ottico, è possibile osservare e normalizzare i cambiamenti tectali all’interno dello stesso campione, consentendo il confronto tra più campioni. I moderni approcci molecolari combinati con questa tecnica forniranno informazioni sui meccanismi alla base della crescita e dello sviluppo del sistema visivo, nonché della degenerazione e rigenerazione assonale.

I sistemi sensoriali – visivi, uditivi e somatosensoriali – raccolgono informazioni dagli organi esterni e trasmettono tali informazioni al sistema nervoso centrale, generando “mappe” del mondo esterno attraverso il mesencefalo ^1,2. La visione è la modalità sensoriale dominante per quasi tutti i vertebrati, compresi molti pesci. La retina, il tessuto neurale dell’occhio, raccoglie informazioni con un circuito neuronale costituito principalmente da fotorecettori, cellule bipolari e cellule gangliari retiniche (RGC), i neuroni di proiezione della retina. Gli RGC hanno lunghi assoni che trovano la loro strada attraverso la superficie interna della retina fino alla testa del nervo ottico, dove si fascicolano e viaggiano insieme attraverso il cervello, terminando infine nel centro di elaborazione visiva nel mesencefalo dorsale. Questa struttura è chiamata tectum ottico nei pesci e in altri vertebrati non mammiferi ed è omologa al collicolo superiore nei mammiferi³.

Il tectum ottico è una struttura multistrato bilateralmente simmetrica nel mesencefalo dorsale. Nel pesce zebra e nella maggior parte degli altri pesci, ogni lobo del tectum ottico riceve input visivi esclusivamente dall’occhio controlaterale, in modo tale che il nervo ottico sinistro termina nel lobo tectale destro e il nervo ottico destro termina nel lobo tectale sinistro⁴ (Figura 1). Come la sua controparte mammifera, il collicolo superiore, il tectum ottico integra le informazioni visive con altri input sensoriali, tra cui l’audizione e la somatosensazione, controllando i cambiamenti nell’attenzione visiva e nei movimenti oculari come le saccadi ^1,5,6. Tuttavia, a differenza del collicolo superiore dei mammiferi, il tectum ottico genera continuamente nuovi neuroni e glia da una nicchia di cellule staminali specializzate vicino ai bordi mediali e caudali dei lobi tettoli chiamati zona di proliferazione tectale⁷. Il mantenimento dei progenitori proliferativi nel tectum ottico e in altre regioni del sistema nervoso centrale contribuisce, in parte, alla notevole capacità rigenerativa documentata nel pesce zebra⁸.

Lavori precedenti che esaminano il cervello di pesci ciechi o con un occhio solo hanno rivelato che la dimensione del tectum ottico è direttamente proporzionale alla quantità di innervazione retinica che riceve ^9,10,11. Nei pesci delle caverne adulti, i cui occhi degenerano nell’embriogenesi precoce, il tectum ottico è notevolmente più piccolo di quello dei pesci di superficie strettamente imparentati e vedenti⁹. La degenerazione dell’occhio di pesce delle caverne può essere bloccata sostituendo la lente endogena con una lente da un pesce di superficie durante l’embriogenesi. Quando questi pesci delle caverne con un occhio solo vengono allevati fino all’età adulta, il lobo tectale innervato contiene circa il 10% in più di cellule rispetto al lobo tectale non innervato⁹. Allo stesso modo, nei killifish larvali che sono stati incubati con trattamenti chimici per generare occhi di dimensioni diverse all’interno dello stesso individuo, il lato del tectum con più innervazione era più grande e conteneva più neuroni¹⁰. Le prove degli esperimenti di schiacciamento del nervo ottico nel pesce rosso adulto indicano che l’innervazione promuove la proliferazione, con la proliferazione delle cellule tettoniche che diminuisce quando l’innervazione è stata interrotta¹¹.

Confermando ed estendendo questi studi classici, diversi rapporti recenti forniscono dati che suggeriscono che la proliferazione in risposta all’innervazione è modulata, almeno in parte, dalla via BDNF-TrkB^12,13. Rimangono molte domande aperte sulla crescita e lo sviluppo del tectum ottico, incluso il modo in cui un sistema sensoriale in via di sviluppo affronta la degenerazione di lesioni e assoni, quali segnali cellulari e molecolari consentono l’input retinico per regolare la crescita del tectum ottico, quando questi meccanismi diventano attivi e se la proliferazione e la differenziazione legate all’innervazione consentono alla retina e al suo tessuto bersaglio di coordinare i tassi di crescita e garantire un’accurata mappatura retinotopica. Inoltre, ci sono domande molto più grandi sullo sviluppo dipendente dall’attività che possono essere affrontate interrogando il sistema visivo del pesce zebra con approcci chirurgici come quello descritto di seguito.

Per studiare i meccanismi cellulari e molecolari con cui l’attività neurale, in particolare dall’input visivo, altera la sopravvivenza e la proliferazione cellulare, l’approccio descritto confronta direttamente i lobi tettoli innervati e denervati (Figura 1) all’interno delle singole larve di zebrafish. Questo metodo consente la documentazione della degenerazione dell’assone RGC nel tectum ottico e la conferma che il numero di cellule mitotiche è correlato all’innervazione.

Figura 1: Schizzi di larve di zebrafish prima e dopo la rimozione unilaterale dell’occhio. (A) Disegno di 5 larve dpf viste al microscopio di dissezione. Ogni larva è incorporata in agarosio a basso punto di fusione e orientata lateralmente prima che un ago di tungsteno con una punta affilata e uncinata venga utilizzato per estrarre l’occhio rivolto verso l’alto (occhio sinistro in questo esempio). (B) Disegno della vista dorsale di una larva di 9 dpf risultante dall’intervento chirurgico raffigurato in A. Solo tre assoni RGC altamente schematizzati dall’occhio destro sono mostrati defascicolare e connettersi con i neuroni nel lobo tectale sinistro. Abbreviazioni: dpf = giorni dopo la fecondazione; dps = giorni dopo l’intervento; RGC = cellule gangliari retiniche. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Protocol

I metodi in questo documento sono stati condotti in conformità con le linee guida e l’approvazione dei comitati istituzionali per la cura e l’uso degli animali del Reed College e dell’University College di Londra. Vedere la Tabella dei materiali per i dettagli sui ceppi di zebrafish utilizzati in questo studio. 1. Preparare materiali e strumenti Crea soluzioni. Creare un mezzo embrionale (E314) diluendo un calcio 60x …

Representative Results

Per confermare se la rimozione dell’occhio fosse completa e valutare come cambia il tectum ottico, sono stati eseguiti interventi chirurgici nel ceppo Tg[atoh7:RFP], che etichetta tutti gli RGC con una RFP mirata alla membrana e, quindi, tutti gli assoni che proiettano dalla retina e formano il nervo ottico24. Sebbene l’uso di questo ceppo non sia assolutamente necessario, consente l’osservazione e la visualizzazione semplici dei termini del nervo ottico nel neuropil del tectum ottico. Sa…

Discussion

Le tecniche descritte in questo articolo illustrano uno dei tanti approcci per lo studio dello sviluppo del sistema visivo dei vertebrati nel pesce zebra. Altri ricercatori hanno pubblicato metodi per sezionare la retina embrionale ed eseguire analisi di espressione genica¹⁹ o visualizzare l’attività neuronale nel tectum ottico³⁰. Questo documento fornisce un approccio per esplorare come l’input retinico differenziale può influenzare i comportamenti cellulari nel tectum o…

Materials

Equipment and supplies:
Breeding boxes	Aquaneering	ZHCT100
Dow Corning high vacuum grease	Sigma or equivalent supplier	Z273554
Erlenmeyer flasks (125 mL)			For making Marc's Modified Ringers (MMR) with antibiotics for post-surgery incubation
Fine forceps – Dumont #5	Fine Science Tools (FST)	11252-20
Glass Pasteur pipettes	DWK Lifescience	63A53 & 63A53WT	For pipetting embryos and larvae
Glass slides for microscopy	VWR or equivalent supplier	48311-703	Standard glass microscope slides can be ordered from many different laboratory suppliers.
Glassware including graduated bottles and graduated cylinders			For making and storing solutions
2-part epoxy resin	ACE Hardware or other equivalent supplier of Gorilla Glue or equivalent	0.85 oz syringe	https://www.acehardware.com/departments/paint-and-supplies/tape-glues-and-adhesives/glues-and-epoxy/1590793
Microcentrifuge tube (1.7 mL)	VWR or equivalent supplier	22234-046
Nickel plated pin holder (17 cm length)	Fine Science Tools (FST)	26018-17	To hold tungsten wire while sharpening and performing surgeries/dissections.
Nylon mesh tea strainer or equivalent	Ali Express or equivalent		For harvesting zebrafish eggs after spawning; https://www.aliexpress.com/item/1005002219569756.html
Paper clip			For Tungsten needle sharpening device.
Petri dishes 100 mm	Fischer Scientific or equivalent supplier	50-190-0267
Petri dishes 35 mm	Fischer Scientific or equivalent supplier	08-757-100A
Pipette pump	SP Bel-Art or equivalent	F37898-0000
Potassium hydroxide (KOH)	Sigma	909122	For Tungsten needle sharpening device. Make a 10% w/v solution of KOH in the hood by adding pellets to deionized water.
Power supply (variable voltage)			For Tungsten needle sharpening device. Any power supply with variable voltage will work (even one used for gel electrophoresis).
Sylgard 184 Elastomer kit	Dow Corning	3097358
Tungsten wire (0.125 mm diameter)	World Precision Instruments (WPI)	TGW0515	Sharpen to remove eye and dissect larvae.
Variable temperature heat block	The Lab Depot or equivalent supplier	BSH1001 or BSH1002	Set to 40-42 °C ahead of experiments.
Wide-mouth glass jar with lid (e.g., clean jam or salsa jar)			For Tungsten needle sharpening device.
Wires with alligator clip leads			For Tungsten needle sharpening device.
Microscopes:
Dissecting microscope			Any type will work but having adjustable transmitted light on a mirrored base is preferred.
Laser scanning confocal microscope			High NA, 20-25x water dipping objective lens is recommended. Microscope control and image capture software (Elements) is used here but any confocal microscope will work.
Reagents for surgeries and dissections:
Calcium chloride dihydrate	Sigma	C7902	For Marc's Modified Ringers (MMR) and embryo medium (E3).
HEPES	Sigma	H7006	For Marc's Modified Ringers (MMR).
Low melting point agarose	Invitrogen	16520-050	Make 1% in embryo medium (E3) or Marc's Modified Ringers (MMR).
Magnesium chloride hexahydrate	Sigma	1374248	For embryo medium (E3).
Magnesium sulfate	Sigma	M7506	For Marc's Modified Ringers (MMR).
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	19210	Dilute 8% (w/v) stock with 2x concentrated PBS (diluted from 10x PBS stock).
Penicillin/Streptomycin	Sigma	P4333-20ML	Dilute 1:100 in Marc's Modified Ringers.
Phosphate buffered saline (PBS) tablets	Diagnostic BioSystems	DMR E404-01	Make 10x stock in deionized water, autoclave and store at room temperature. Dilute to 1x working concentration.
Potassium chloride	Sigma	P3911	For Marc's Modified Ringers (MMR) and embryo medium (E3).
Sodium chloride	Sigma	S9888	For Marc's Modified Ringers (MMR) and embryo medium (E3).
Sodium hydroxide	Sigma	S5881	Make 10 M and use to adjust pH of MMR to 7.4.
Sucrose	Sigma	S9378
Tricaine-S	Pentair	100G #TRS1	Recipe: https://zfin.atlassian.net/wiki/spaces/prot/pages/362220023/TRICAINE
Reagents for immunohistochemistry:
Alexafluor 568 tagged Secondary antibody to detect rabbit IgG	Invitrogen	A-11011	Use at 1:500 dilution for wholemount immunohistochemistry.
DAPI or ToPro3	Invitrogen	1306 or T3605	Make up 1 mg/mL solutions in DMSO; 1:5,000 dilution for counterstaining.
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma	D8418	A component of immunoblock buffer.
Methanol (MeOH)	Sigma	34860	Mixing MeOH with aqueous solutions like PBST is exothermic. Make the MeOH/PBST solutions at least several hours ahead of time or cool them on ice before using.
Normal goat serum	ThermoFisher Scientific	50-062Z	A component of immunoblock buffer. Can be aliquoted in 1-10 mL volumes and stored at -20 °C.
Primary antibody to detect phosphohistone H3	Millipore	06-570	Use at 1:300 dilution for wholemount immunohistochemistry.
Primary antibody to detect Red Fluorescent Protein (RFP; detects dsRed derivatives)	MBL International	PM005	Use at 1:500 dilution for wholemount immunohistochemistry.
Proteinase K (PK)	Sigma	P2308-10MG	Make up 10 mg/mL stock solutions in PBS and use at 10 µg/mL.
Triton X-100	Sigma	T8787	Useful to make a 20% (v/v) stock solution in PBS.
Software for data analysis
ImageJ (Fiji)			freeware for image analysis; https://imagej.net/software/fiji/
Rstudio			freeware for statistical analysis and data visualization; https://www.rstudio.com/products/rstudio/download/
Adobe Photoshop or GIMP			Proprietary image processing software (Adobe Photoshop and Illustrator) are often used to compose figures). A freeware alternative is Gnu Image Manipulation Program (GIMP; https://www.gimp.org/)
Zebrafish strains			available from the  Zebrafish International Resource Centers in the US (https://zebrafish.org/home/guide.php) or in Europe (https://www.ezrc.kit.edu/). Specialized transgenic strains that have not yet been deposited in either resource center can be requested from individual labs after publication.