Удаление глаз у живых личинок рыбок данио для изучения иннерваторно-зависимого роста и развития зрительной системы
Summary
В статье объясняется, как хирургически удалить глаза у живых личинок рыбок данио в качестве первого шага к исследованию того, как вход сетчатки влияет на рост и развитие зрительного тектума. Кроме того, в статье представлена информация об обезболивании личинок, фиксации и рассечении мозга с последующей иммуногистохимией и конфокальной визуализацией.
Abstract
Рыбки данио демонстрируют замечательный пожизненный рост и регенеративные способности. Например, специализированные ниши стволовых клеток, созданные во время эмбриогенеза, поддерживают непрерывный рост всей зрительной системы, как в глазу, так и в мозге. Скоординированный рост между сетчаткой и оптическим тектумом обеспечивает точное ретинотопическое картирование по мере добавления новых нейронов в глаза и мозг. Чтобы решить, предоставляют ли аксоны сетчатки важную информацию для регулирования поведения тектальных стволовых и клеток-предшественников, таких как выживание, пролиферация и / или дифференцировка, необходимо иметь возможность сравнивать иннервированные и денервированные тектальные доли внутри одного и того же животного и у разных животных.
Хирургическое удаление одного глаза у живой личинки рыбки данио с последующим наблюдением за оптическим тектумом достигает этой цели. В сопроводительном видео показано, как обезболить личинок, электролитически заточить вольфрамовые иглы, и использовать их для удаления одного глаза. Далее показано, как препарировать мозг у неподвижных личинок рыбок данио. Наконец, видео содержит обзор протокола иммуногистохимии и демонстрацию того, как монтировать окрашенные эмбрионы в агарозу с низкой температурой плавления для микроскопии.
Introduction
Целью этого метода является исследование того, как вход сетчатки влияет на рост и развитие оптического тектума, центра визуальной обработки в мозге рыбок данио. Удалив один глаз, а затем сравнив две стороны оптического тектума, можно наблюдать и нормализовать тектальные изменения в одном образце, что позволяет сравнивать несколько образцов. Современные молекулярные подходы в сочетании с этой техникой дадут представление о механизмах, лежащих в основе роста и развития зрительной системы, а также аксональной дегенерации и регенерации.
Сенсорные системы – зрительная, слуховая и соматосенсорная – собирают информацию от внешних органов и передают эту информацию в центральную нервную систему, генерируя «карты» внешнего мира по среднему мозгу 1,2. Зрение является доминирующей сенсорной модальностью почти для всех позвоночных, включая многих рыб. Сетчатка, нервная ткань в глазу, собирает информацию с помощью нейронной цепи, состоящей в основном из фоторецепторов, биполярных клеток и ганглиозных клеток сетчатки (RGC), проекционных нейронов сетчатки. RGC имеют длинные аксоны, которые находят свой путь через внутреннюю поверхность сетчатки к головке зрительного нерва, где они фасцикулируют и путешествуют вместе через мозг, в конечном итоге заканчиваясь в центре визуальной обработки в спинном среднем мозге. Эта структура называется оптическим тектумом у рыб и других позвоночных, не являющихся млекопитающими, и гомологична верхнему колликулусу у млекопитающих3.
Оптический тектум представляет собой двусторонне симметричную многослойную структуру в спинном среднем мозге. У рыбок данио и большинства других рыб каждая доля зрительного тектума получает визуальный ввод исключительно от контралатерального глаза, так что левый зрительный нерв заканчивается в правой тектальной доле, а правый зрительный нерв заканчивается в левой тектальной доле4 (рисунок 1). Как и его аналог млекопитающих, превосходный колликулус, оптический тектум интегрирует визуальную информацию с другими сенсорными входами, включая прослушивание и соматозондирование, контролируя сдвиги в зрительном внимании и движениях глаз, таких как саккады 1,5,6. Однако, в отличие от верхнего колликулуса млекопитающих, оптический тектум непрерывно генерирует новые нейроны и глию из специализированной ниши стволовых клеток вблизи медиального и каудального краев тектальных долей, называемой зоной текальной пролиферации7. Поддержание пролиферативных предшественников в тектуме зрительного нерва и других областях центральной нервной системы частично способствует замечательной регенеративной способности, задокументированной у рыбок данио8.
Предыдущая работа, изучающая мозг слепых или одноглазых рыб, показала, что размер зрительного тектума прямо пропорционален количеству иннервации сетчатки, которую он получает 9,10,11. У взрослых пещерных рыб, глаза которых вырождаются в раннем эмбриогенезе, оптический тектум заметно меньше, чем у близкородственных, видимых поверхностных рыб9. Дегенерация глаза пещерной рыбы может быть заблокирована путем замены эндогенной линзы линзой от поверхностной рыбы во время эмбриогенеза. Когда эти одноглазые пещерные рыбы выращиваются до зрелого возраста, иннервированная тектальная доля содержит примерно на 10% больше клеток, чем неиннервированная тектальная доля9. Аналогичным образом, у личинок киллифиш, которые инкубировались с помощью химической обработки для создания глаз разных размеров в пределах одного и того же человека, сторона тектума с большей иннервацией была больше и содержала больше нейронов10. Данные экспериментов по раздавливанию зрительного нерва у взрослых золотых рыбок указывают на то, что иннервация способствует пролиферации, при этом пролиферация тектальных клеток уменьшается, когда иннервация была нарушена11.
Подтверждая и расширяя эти классические исследования, несколько недавних докладов предоставляют данные, свидетельствующие о том, что пролиферация в ответ на иннервацию модулируется, по крайней мере частично, путем BDNF-TrkB12,13. Остается много открытых вопросов о росте и развитии оптического тектума, в том числе о том, как развивающаяся сенсорная система справляется с травмой и дегенерацией аксонов, какие клеточные и молекулярные сигналы позволяют входу сетчатки регулировать рост зрительного тектума, когда эти механизмы становятся активными, и позволяют ли иннервационная пролиферация и дифференцировка сетчатке и ее целевой ткани координировать темпы роста и обеспечивать точное ретинотопическое картирование. Кроме того, существуют гораздо более широкие вопросы о развитии, зависящем от активности, которые можно решить, опросив зрительную систему рыбок данио с помощью хирургических подходов, таких как описанный ниже.
Чтобы исследовать клеточные и молекулярные механизмы, с помощью которых нейронная активность, в частности от визуального ввода, изменяет выживание и пролиферацию клеток, описанный подход непосредственно сравнивает иннервированные и денервированные тектальные доли (рисунок 1) в отдельных личинках рыбок данио. Этот метод позволяет документировать дегенерацию аксона RGC в тектуме зрительного нерва и подтвердить, что количество митотических клеток коррелирует с иннервацией.
Рисунок 1: Эскизы личинок рыбок данио до и после одностороннего удаления глаз. (А) Рисование 5 личинок dpf при просмотре под рассекающим микроскопом. Каждая личинка встроена в агарозу с низкой температурой плавления и ориентирована сбоку, прежде чем вольфрамовая игла с острым крючковатым кончиком используется для вычерпывания глаза лицом вверх (левый глаз в этом примере). (B) Рисунок дорсального вида личинки 9 dpf в результате операции, изображенной в A. Только три сильно схематизированных аксона RGC от правого глаза дефасцикулируют и соединяются с нейронами в левой тектальной доле. Сокращения: dpf = дни после оплодотворения; dps = дни после операции; RGC = ганглиозные клетки сетчатки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Protocol
Representative Results
Discussion
Методы, описанные в этой статье, иллюстрируют один из многих подходов к изучению развития зрительной системы позвоночных у рыбок данио. Другие исследователи опубликовали методы рассечения эмбриональной сетчатки и проведения анализа экспрессии генов19 или визуализации ак…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Финансирование этой работы было поддержано в основном стартовыми фондами от Reed College до KLC, фондами Исследовательской стипендии Хелен Стаффорд для OLH и стипендией Reed College Science Research Fellowship для YK. Этот проект начался в лаборатории Стива Уилсона как сотрудничество с HR, который был поддержан Wellcome Trust Studentship (2009-2014). Мы благодарим Мате Варгу, Стива Уилсона и других членов лаборатории Уилсона за первоначальные обсуждения этого проекта, и мы особенно благодарим Флоренсию Каводеасси и Кейт Эдвардс, которые первыми научили KLC, как вводить эмбрионы в агарозу и выполнять рассечение мозга рыбок данио. Мы также благодарим Грету Гловер и Джея Юинга за помощь в сборке нашего устройства для заточки вольфрамовой иглы.
Materials
| Equipment and supplies: | |||
| Breeding boxes | Aquaneering | ZHCT100 | |
| Dow Corning high vacuum grease | Sigma or equivalent supplier | Z273554 | |
| Erlenmeyer flasks (125 mL) | For making Marc's Modified Ringers (MMR) with antibiotics for post-surgery incubation | ||
| Fine forceps – Dumont #5 | Fine Science Tools (FST) | 11252-20 | |
| Glass Pasteur pipettes | DWK Lifescience | 63A53 & 63A53WT | For pipetting embryos and larvae |
| Glass slides for microscopy | VWR or equivalent supplier | 48311-703 | Standard glass microscope slides can be ordered from many different laboratory suppliers. |
| Glassware including graduated bottles and graduated cylinders | For making and storing solutions | ||
| 2-part epoxy resin | ACE Hardware or other equivalent supplier of Gorilla Glue or equivalent | 0.85 oz syringe | https://www.acehardware.com/departments/paint-and-supplies/tape-glues-and-adhesives/glues-and-epoxy/1590793 |
| Microcentrifuge tube (1.7 mL) | VWR or equivalent supplier | 22234-046 | |
| Nickel plated pin holder (17 cm length) | Fine Science Tools (FST) | 26018-17 | To hold tungsten wire while sharpening and performing surgeries/dissections. |
| Nylon mesh tea strainer or equivalent | Ali Express or equivalent | For harvesting zebrafish eggs after spawning; https://www.aliexpress.com/item/1005002219569756.html | |
| Paper clip | For Tungsten needle sharpening device. | ||
| Petri dishes 100 mm | Fischer Scientific or equivalent supplier | 50-190-0267 | |
| Petri dishes 35 mm | Fischer Scientific or equivalent supplier | 08-757-100A | |
| Pipette pump | SP Bel-Art or equivalent | F37898-0000 | |
| Potassium hydroxide (KOH) | Sigma | 909122 | For Tungsten needle sharpening device. Make a 10% w/v solution of KOH in the hood by adding pellets to deionized water. |
| Power supply (variable voltage) | For Tungsten needle sharpening device. Any power supply with variable voltage will work (even one used for gel electrophoresis). | ||
| Sylgard 184 Elastomer kit | Dow Corning | 3097358 | |
| Tungsten wire (0.125 mm diameter) | World Precision Instruments (WPI) | TGW0515 | Sharpen to remove eye and dissect larvae. |
| Variable temperature heat block | The Lab Depot or equivalent supplier | BSH1001 or BSH1002 | Set to 40-42 °C ahead of experiments. |
| Wide-mouth glass jar with lid (e.g., clean jam or salsa jar) | For Tungsten needle sharpening device. | ||
| Wires with alligator clip leads | For Tungsten needle sharpening device. | ||
| Microscopes: | |||
| Dissecting microscope | Any type will work but having adjustable transmitted light on a mirrored base is preferred. | ||
| Laser scanning confocal microscope | High NA, 20-25x water dipping objective lens is recommended. Microscope control and image capture software (Elements) is used here but any confocal microscope will work. |
||
| Reagents for surgeries and dissections: | |||
| Calcium chloride dihydrate | Sigma | C7902 | For Marc's Modified Ringers (MMR) and embryo medium (E3). |
| HEPES | Sigma | H7006 | For Marc's Modified Ringers (MMR). |
| Low melting point agarose | Invitrogen | 16520-050 | Make 1% in embryo medium (E3) or Marc's Modified Ringers (MMR). |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma | 1374248 | For embryo medium (E3). |
| Magnesium sulfate | Sigma | M7506 | For Marc's Modified Ringers (MMR). |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 19210 | Dilute 8% (w/v) stock with 2x concentrated PBS (diluted from 10x PBS stock). |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma | P4333-20ML | Dilute 1:100 in Marc's Modified Ringers. |
| Phosphate buffered saline (PBS) tablets | Diagnostic BioSystems | DMR E404-01 | Make 10x stock in deionized water, autoclave and store at room temperature. Dilute to 1x working concentration. |
| Potassium chloride | Sigma | P3911 | For Marc's Modified Ringers (MMR) and embryo medium (E3). |
| Sodium chloride | Sigma | S9888 | For Marc's Modified Ringers (MMR) and embryo medium (E3). |
| Sodium hydroxide | Sigma | S5881 | Make 10 M and use to adjust pH of MMR to 7.4. |
| Sucrose | Sigma | S9378 | |
| Tricaine-S | Pentair | 100G #TRS1 | Recipe: https://zfin.atlassian.net/wiki/spaces/prot/pages/362220023/TRICAINE |
| Reagents for immunohistochemistry: | |||
| Alexafluor 568 tagged Secondary antibody to detect rabbit IgG | Invitrogen | A-11011 | Use at 1:500 dilution for wholemount immunohistochemistry. |
| DAPI or ToPro3 | Invitrogen | 1306 or T3605 | Make up 1 mg/mL solutions in DMSO; 1:5,000 dilution for counterstaining. |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D8418 | A component of immunoblock buffer. |
| Methanol (MeOH) | Sigma | 34860 | Mixing MeOH with aqueous solutions like PBST is exothermic. Make the MeOH/PBST solutions at least several hours ahead of time or cool them on ice before using. |
| Normal goat serum | ThermoFisher Scientific | 50-062Z | A component of immunoblock buffer. Can be aliquoted in 1-10 mL volumes and stored at -20 °C. |
| Primary antibody to detect phosphohistone H3 | Millipore | 06-570 | Use at 1:300 dilution for wholemount immunohistochemistry. |
| Primary antibody to detect Red Fluorescent Protein (RFP; detects dsRed derivatives) | MBL International | PM005 | Use at 1:500 dilution for wholemount immunohistochemistry. |
| Proteinase K (PK) | Sigma | P2308-10MG | Make up 10 mg/mL stock solutions in PBS and use at 10 µg/mL. |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | Useful to make a 20% (v/v) stock solution in PBS. |
| Software for data analysis | |||
| ImageJ (Fiji) | freeware for image analysis; https://imagej.net/software/fiji/ | ||
| Rstudio | freeware for statistical analysis and data visualization; https://www.rstudio.com/products/rstudio/download/ | ||
| Adobe Photoshop or GIMP | Proprietary image processing software (Adobe Photoshop and Illustrator) are often used to compose figures). A freeware alternative is Gnu Image Manipulation Program (GIMP; https://www.gimp.org/) | ||
| Zebrafish strains | available from the Zebrafish International Resource Centers in the US (https://zebrafish.org/home/guide.php) or in Europe (https://www.ezrc.kit.edu/). Specialized transgenic strains that have not yet been deposited in either resource center can be requested from individual labs after publication. |
Riferimenti
- Butler, A. B., Hodos, W. Optic tectum. Comparative Vertebrate Neuroanatomy: Evolution and Adaptation. , 311-340 (2005).
- Cang, J., Feldheim, D. A. Developmental mechanisms of topographic map formation and alignment. Annual Review of Neuroscience. 36 (1), 51-77 (2013).
- Basso, M. A., Bickford, M. E., Cang, J. Unraveling circuits of visual perception and cognition through the superior colliculus. Neuron. 109 (6), 918-937 (2021).
- Burrill, J. D., Easter, S. S. Development of the retinofugal projections in the embryonic and larval zebrafish (Brachydanio rerio). The Journal of Comparative Neurology. 346 (4), 583-600 (1994).
- Regeneration in the goldfish visual system. Webvision: The Organization of the Retina and Visual System Available from: https://webvision.med.utah.edu/book/part-x-repair-and-regeneration-in-the-visual-system/regeneration-in-the-goldfish-visual-system/ (2021)
- Regeneration in the visual system of adult mammals. Webvision: The Organization of the Retina and Visual System Available from: https://webvision.med.utah.edu/book/part-x-repair-and-regeneration-in-the-visual-system/regeneration-in-the-visual-system-of-adult-mammals/ (2021)
- Cerveny, K. L., Varga, M., Wilson, S. W. Continued growth and circuit building in the anamniote visual system. Developmental Neurobiology. 72 (3), 328-345 (2012).
- Lindsey, B. W., et al. Midbrain tectal stem cells display diverse regenerative capacities in zebrafish. Scientific Reports. 9 (1), 4420 (2019).
- Soares, D., Yamamoto, Y., Strickler, A. G., Jeffery, W. R. The lens has a specific influence on optic nerve and tectum development in the blind cavefish Astyanax. Developmental Neuroscience. 26 (5-6), 308-317 (2004).
- White, E. L. An experimental study of the relationship between the size of the eye and the size of the optic tectum in the brain of the developing teleost, Fundulus heteroclitus. Journal of Experimental Zoology. 108 (3), 439-469 (1948).
- Raymond, P., Easter, S., Burnham, J., Powers, M. Postembryonic growth of the optic tectum in goldfish. II. Modulation of cell proliferation by retinal fiber input. The Journal of Neuroscience. 3 (5), 1092-1099 (1983).
- Sato, Y., Yano, H., Shimizu, Y., Tanaka, H., Ohshima, T. Optic nerve input-dependent regulation of neural stem cell proliferation in the optic tectum of adult zebrafish. Developmental Neurobiology. 77 (4), 474-482 (2017).
- Hall, Z. J., Tropepe, V. Visual experience facilitates BDNF-dependent adaptive recruitment of new neurons in the postembryonic optic tectum. The Journal of Neuroscience. 38 (8), 2000-2014 (2018).
- Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. . Zebrafish. , (2002).
- Cold Spring Harbor Protocols. Marc’s modified Ringer’s (MMR) (10X, pH 7.4). Cold Spring Harbor Protocols. , (2009).
- Turner, K. J., Bracewell, T. G., Hawkins, T. A. Anatomical dissection of zebrafish brain development. Brain Development. 1082, 197-214 (2014).
- Brady, J. A simple technique for making very fine, durable dissecting needles by sharpening tungsten wire electrolytically. Bulletin of the World Health Organization. 32 (1), 143-144 (1965).
- . ZFIN Tricaine recipe Available from: https://zfin.atlassian.net/wiki/spaces/prot/pages/362220023/TRICAINE (2018)
- Zhang, L., Leung, Y. F. Microdissection of zebrafish embryonic eye tissues. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (40), e2028 (2010).
- . ZFIN protocols Available from: https://zfin.atlassian.net/wiki/spaces/prot/overview (2021)
- Engerer, P., Plucinska, G., Thong, R., Trovò, L., Paquet, D., Godinho, L. Imaging subcellular structures in the living zebrafish embryo. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (110), e53456 (2016).
- ImageJ with batteries included. Fiji Available from: https://figi.sc/ (2021)
- O’Brien, J., Hayder, H., Peng, C. Automated quantification and analysis of cell counting procedures using ImageJ plugins. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (117), e54719 (2016).
- Poggi, L., Vitorino, M., Masai, I., Harris, W. A. Influences on neural lineage and mode of division in the zebrafish retina in vivo. The Journal of Cell Biology. 171 (6), 991-999 (2005).
- Karlstrom, R. O., et al. Zebrafish mutations affecting retinotectal axon pathfinding. Development. 123 (1), 427-438 (1996).
- Harvey, B. M., Baxter, M., Granato, M. Optic nerve regeneration in larval zebrafish exhibits spontaneous capacity for retinotopic but not tectum specific axon targeting. PLOS ONE. 14 (6), 0218667 (2019).
- Robles, E., Filosa, A., Baier, H. Precise lamination of retinal axons generates multiple parallel input pathways in the tectum. Journal of Neuroscience. 33 (11), 5027-5039 (2013).
- Vargas, M. E., Barres, B. A. Why Is Wallerian degeneration in the CNS so slow. Annual Review of Neuroscience. 30 (1), 153-179 (2007).
- Hughes, A. N., Appel, B. Microglia phagocytose myelin sheaths to modify developmental myelination. Nature Neuroscience. 23 (9), 1055-1066 (2020).
- de Calbiac, H., Dabacan, A., Muresan, R., Kabashi, E., Ciura, S. Behavioral and physiological analysis in a zebrafish model of epilepsy. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (176), e58837 (2021).
- Adams, S. L., Zhang, T., Rawson, D. M. The effect of external medium composition on membrane water permeability of zebrafish (Danio rerio) embryos. Theriogenology. 64 (7), 1591-1602 (2005).
- Fredj, N. B., et al. Synaptic activity and activity-dependent competition regulates axon arbor maturation, growth arrest, and territory in the retinotectal projection. Journal of Neuroscience. 30 (32), 10939-10951 (2010).
- Alberio, L., et al. A light-gated potassium channel for sustained neuronal inhibition. Nature Methods. 15 (11), 969-976 (2018).
- Kay, J. N., Finger-Baier, K. C., Roeser, T., Staub, W., Baier, H. Retinal ganglion cell genesis requires lakritz, a zebrafish atonal homolog. Neuron. 30 (3), 725-736 (2001).
- Gnuegge, L., Schmid, S., Neuhauss, S. C. F. Analysis of the activity-deprived zebrafish mutant macho reveals an essential requirement of neuronal activity for the development of a fine-grained visuotopic map. The Journal of Neuroscience. 21 (10), 3542-3548 (2001).
- Jeffery, W. R. Astyanax surface and cave fish morphs. EvoDevo. 11 (1), 14 (2020).
- Sieger, D., Peri, F. Animal models for studying microglia: The first, the popular, and the new. Glia. 61 (1), 3-9 (2013).
- Svahn, A. J., et al. Development of ramified microglia from early macrophages in the zebrafish optic tectum. Developmental Neurobiology. 73 (1), 60-71 (2013).
- Herzog, C., et al. Rapid clearance of cellular debris by microglia limits secondary neuronal cell death after brain injury in vivo. Development. 146 (9), (2019).
- Chen, J., Poskanzer, K. E., Freeman, M. R., Monk, K. R. Live-imaging of astrocyte morphogenesis and function in zebrafish neural circuits. Nature Neuroscience. 23 (10), 1297-1306 (2020).
