Isolierung von primären Mausmikroglia durch magnetisch aktivierte Zellsortierung in Tiermodellen der Demyelinisierung
Summary
Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Isolierung und Reinigung primärer Mikroglia in Tiermodellen demyelinisierender Krankheiten unter Verwendung der säulenförmigen magnetisch aktivierten Zellsortierung.
Abstract
Mikroglia, die ansässigen angeborenen Immunzellen im Gehirn, sind die primären Reaktionspersonen auf Entzündungen oder Verletzungen im zentralen Nervensystem (ZNS). Mikroglia können in Ruhezustand und aktivierten Zustand unterteilt werden und können ihren Zustand als Reaktion auf die Mikroumgebung des Gehirns schnell ändern. Mikroglia werden unter verschiedenen pathologischen Bedingungen aktiviert und weisen unterschiedliche Phänotypen auf. Darüber hinaus gibt es viele verschiedene Untergruppen aktivierter Mikroglia und eine große Heterogenität zwischen verschiedenen Untergruppen. Die Heterogenität hängt hauptsächlich von der molekularen Spezifität von Mikroglia ab. Studien haben gezeigt, dass Mikroglia aktiviert werden und eine wichtige Rolle im pathologischen Prozess der entzündlichen Demyelinisierung spielen. Um die Eigenschaften von Mikroglia bei entzündlichen demyelinisierenden Erkrankungen wie Multipler Sklerose und Neuromyelitis optica spectrum disorder besser zu verstehen, schlagen wir ein periläsionales primäres Mikroglia-Sortierprotokoll vor. Dieses Protokoll verwendet säulenförmige magnetisch aktivierte Zellsortierung (MACS), um hochgereinigte primäre Mikroglia zu erhalten und die molekularen Eigenschaften von Mikroglia zu erhalten, um die möglichen Auswirkungen von Mikroglia bei entzündlichen demyelinisierenden Erkrankungen zu untersuchen.
Introduction
Mikroglia stammen von Dotter-Sack-Vorläufern, die sehr früh das embryonale Gehirn erreichen und an der Entwicklung des ZNS 1,2 beteiligt sind. Zum Beispiel sind sie am synaptischen Beschneiden3 und der Regulierung des axonalen Wachstumsbeteiligt 4. Sie sezernieren Faktoren, die das neuronale Überleben fördern und die neuronale Lokalisation unterstützen5. Gleichzeitig sind sie an der Entfernung abnormaler Zellen und apoptotischer Zellen beteiligt, um eine normale Gehirnentwicklung zu gewährleisten6. Darüber hinaus überwachen Mikroglia als immunkompetente Zellen des Gehirns kontinuierlich das Gehirnparenchym, um tote Zellen, dysfunktionale Synapsen und Zelltrümmer zu beseitigen7. Es wurde gezeigt, dass die Mikrogliaaktivierung eine wichtige Rolle bei einer Vielzahl von Krankheiten spielt, einschließlich entzündlicher demyelinisierender Erkrankungen, neurodegenerativer Erkrankungen und Hirntumoren. Aktivierte Mikroglia bei Multipler Sklerose (MS) tragen zur Differenzierung von Oligodendrozyten-Vorläuferzellen (OPCs) und zur Regeneration von Myelin bei, indem sie Myelintrümmer8 verschlingen.
Bei der Alzheimer-Krankheit (AD) aktiviert die Ansammlung von Amyloid-Beta (Aβ) Mikroglia, die die phagozytären und entzündlichen Funktionen der Mikroglia9 beeinflusst. Aktivierte Mikroglia im Gliomgewebe, sogenannte Gliom-assoziierte Mikroglia (GAM), können das Fortschreiten des Glioms regulieren und letztendlich die Prognose der Patientenbeeinflussen 10. Die Aktivierung verändert das Mikroglia-Transkriptom tiefgreifend, was zu morphologischen Veränderungen, der Expression von Immunrezeptoren, erhöhter phagozytischer Aktivität und einer verbesserten Zytokinsekretionführt 11. Es gibt verschiedene Untergruppen von aktivierten Mikroglia bei neurodegenerativen Erkrankungen wie krankheitsassoziierte Mikroglia (DAM), aktivierte Reaktionsmikroglia (ARM) und mikroglialer neurodegenerativer Phänotyp (MGnD)8.
In ähnlicher Weise koexistieren mehrere dynamische funktionelle Untergruppen von Mikroglia auch im Gehirn bei entzündlichen demyelinisierenden Erkrankungen12. Das Verständnis der Heterogenität zwischen verschiedenen Untergruppen von Mikroglia ist unerlässlich, um die Pathogenese entzündlicher demyelinisierender Erkrankungen zu untersuchen und ihre potenziellen therapeutischen Strategien zu finden. Die Heterogenität von Mikroglia hängt hauptsächlich von der molekularen Spezifitätab 8. Es ist wichtig, die molekularen Veränderungen von Mikroglia für die Untersuchung der Heterogenität genau zu beschreiben. Fortschritte in der Einzelzell-RNA-Sequenzierungstechnologie (RNA-seq) haben die Identifizierung der molekularen Eigenschaften aktivierter Mikroglia unter pathologischen Zuständenermöglicht 13. Daher ist die Fähigkeit, Zellpopulationen zu isolieren, entscheidend für die weitere Untersuchung dieser Zielzellen unter bestimmten Bedingungen.
Studien, die durchgeführt wurden, um die Eigenschaften und Funktionen von Mikroglia zu verstehen, sind in der Regel In-vitro-Studien, da festgestellt wurde, dass eine große Anzahl von primären Mikroglia aus Mauswelpengehirnen (1-3 Tage alt) hergestellt und kultiviert werden kann, die an den Kulturkolben haften und auf der Kunststoffoberfläche mit anderen gemischten Gliazellen wachsen. Anschließend können reine Mikroglia basierend auf der unterschiedlichen Haftfähigkeit von gemischten Gliazellenisoliert werden 14,15. Diese Methode kann jedoch nur Mikroglia aus dem perinatalen Gehirn isolieren und dauert mehrere Wochen. Potentielle Variablen in der Zellkultur können Mikroglia-Eigenschaften wie die molekulare Expressionbeeinflussen 16. Darüber hinaus können Mikroglia, die mit diesen Methoden isoliert werden, nur an In-vitro-Experimenten teilnehmen, indem sie die Bedingungen von ZNS-Erkrankungen simulieren, und können die Eigenschaften und Funktionen von Mikroglia in In-vivo-Krankheitszuständen nicht darstellen. Daher ist es notwendig, Methoden zur Isolierung von Mikroglia aus dem erwachsenen Mäusegehirn zu entwickeln.
Fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) und magnetische Trennung sind zwei weit verbreitete Methoden, obwohl sie ihre eigenen unterschiedlichen Einschränkungen haben16,17,18,19. Ihre jeweiligen Vor- und Nachteile werden im Diskussionsteil gegenübergestellt. Die Reifung der MACS-Technologie bietet die Möglichkeit, Zellen schnell zu reinigen. Huang et al. haben eine bequeme Methode entwickelt, um demyelinisierende Läsionen im Gehirnzu markieren 20. Durch die Kombination dieser beiden technischen Ansätze schlagen wir ein schnelles und effizientes säulenförmiges magnetisches CD11b-Trennprotokoll vor, das eine Schritt-für-Schritt-Beschreibung zur Isolierung von Mikroglia um demyelinisierende Läsionen in erwachsenen Mäusegehirnen und die Erhaltung der molekularen Eigenschaften von Mikroglia liefert. Die fokalen demyelinisierenden Läsionen wurden durch die stereotaktische Injektion von 2 μL Lysolecithinlösung (1% LPC in 0,9% NaCl) in das Corpus callosum 3 Tage vor Beginn des Protokolls21 verursacht. Dieses Protokoll legt den Grundstein für die Durchführung des nächsten Schritts in In-vitro-Experimenten. Darüber hinaus spart dieses Protokoll Zeit und bleibt für den breiten Einsatz in verschiedenen Experimenten machbar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das Protokoll schlägt eine Methode zur Isolierung von Mikroglia um die demyelinisierenden Läsionen vor, die helfen kann, die funktionellen Eigenschaften von Mikroglia bei entzündlichen demyelinisierenden Erkrankungen zu untersuchen. Mikroglia, die mit CD11b-Perlen gewonnen wurden, weisen eine hohe Reinheit und Lebensfähigkeit auf. Kritische Schritte im Protokoll sind die genaue Lokalisierung von Herden und die optimale Reinigung von Mikroglia. Im Protokollschritt 2.1 ist es notwendig, die NR-Lösung 2 h zu injizieren…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Studie wurde von der Tongji Hospital (HUST) Foundation for Excellent Young Scientist (Grant No. 2020YQ06) unterstützt.
Materials
| 1.5 mL Micro Centrifuge Tubes | BIOFIL | CFT001015 | |
| 15 mL Centrifuge Tubes | BIOFIL | CFT011150 | |
| 50 mL Centrifuge Tubes | BIOFIL | CFT011500 | |
| 70 µm Filter | Miltenyi Biotec | 130-095-823 | |
| Adult Brain Dissociation Kit, mouse and rat | Miltenyi Biotec | 130-107-677 | |
| C57BL/6J Mice | SJA Labs | ||
| CD11b (Microglia) Beads, human and mouse | Miltenyi Biotec | 130-093-634 | |
| Fetal Bovine Serum | BOSTER | PYG0001 | |
| FlowJo | BD Biosciences | V10 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| MiniMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
| MS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Neutral Red | Sigma-Aldrich | 1013690025 | |
| NovoCyte Flow Cytometer | Agilent | A system consisting of various parts | |
| NovoExpress | Agilent | 1.4.1 | |
| PBS | BOSTER | PYG0021 | |
| Pentobarbital | Sigma-Aldrich | P-010 | |
| Stereomicroscope | MshOt | MZ62 |
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