Isolement de la microglie primaire de souris par tri cellulaire activé magnétiquement dans des modèles animaux de démyélinisation
Summary
Nous présentons ici un protocole pour isoler et purifier la microglie primaire dans des modèles animaux de maladies démyélinisantes, en utilisant le tri cellulaire activé magnétiquement en colonne.
Abstract
Les microglies, les cellules immunitaires innées résidentes dans le cerveau, sont les principaux répondeurs à l’inflammation ou aux blessures du système nerveux central (SNC). La microglie peut être divisée en état de repos et en état activé et peut rapidement changer d’état en réponse au microenvironnement du cerveau. La microglie sera activée dans différentes conditions pathologiques et présentera différents phénotypes. En outre, il existe de nombreux sous-groupes différents de microglies activées et une grande hétérogénéité entre différents sous-groupes. L’hétérogénéité dépend principalement de la spécificité moléculaire de la microglie. Des études ont révélé que la microglie sera activée et jouera un rôle important dans le processus pathologique de démyélinisation inflammatoire. Pour mieux comprendre les caractéristiques de la microglie dans les maladies inflammatoires démyélinisantes telles que la sclérose en plaques et le trouble du spectre de la neuromyélite optique, nous proposons un protocole de tri microglial primaire périlésionnel. Ce protocole utilise le tri cellulaire activé magnétiquement en colonne (MACS) pour obtenir une microglie primaire hautement purifiée et préserver les caractéristiques moléculaires de la microglie afin d’étudier les effets potentiels de la microglie dans les maladies inflammatoires démyélinisantes.
Introduction
Les microglies proviennent de progéniteurs du sac vitellin, qui atteignent très tôt le cerveau embryonnaire et participent au développement du SNC 1,2. Par exemple, ils sont impliqués dans l’élagage synaptique3 et la régulation de la croissance axonale4. Ils sécrètent des facteurs qui favorisent la survie neuronale et aident à la localisation neuronale5. Dans le même temps, ils sont impliqués dans l’élimination des cellules anormales et des cellules apoptotiques pour assurer le développement normal du cerveau6. En outre, en tant que cellules immunocompétentes du cerveau, les microglies surveillent continuellement le parenchyme cérébral pour éliminer les cellules mortes, les synapses dysfonctionnelles et les débris cellulaires7. Il a été démontré que l’activation microgliale joue un rôle important dans une variété de maladies, y compris les maladies inflammatoires démyélinisantes, les maladies neurodégénératives et les tumeurs cérébrales. Les microglies activées dans la sclérose en plaques (SEP) contribuent à la différenciation des cellules précurseurs des oligodendrocytes (OPC) et à la régénération de la myéline en engloutissant les débris de myéline8.
Dans la maladie d’Alzheimer (MA), l’accumulation de bêta-amyloïde (Aβ) active la microglie, ce qui affecte les fonctions phagocytaires et inflammatoires de la microglie9. La microglie activée dans le tissu du gliome, appelée microglie associée au gliome (GAM), peut réguler la progression du gliome et finalement affecter le pronostic des patients10. L’activation modifie profondément le transcriptome microglial, entraînant des changements morphologiques, l’expression des récepteurs immunitaires, une augmentation de l’activité phagocytaire et une augmentation de la sécrétion de cytokines11. Il existe différents sous-ensembles de microglies activées dans les maladies neurodégénératives telles que la microglie associée à la maladie (DAM), la microglie à réponse activée (ARM) et le phénotype neurodégénératif microglial (MGnD)8.
De même, de multiples sous-ensembles fonctionnels dynamiques de microglies coexistent également dans le cerveau dans les maladies inflammatoires démyélinisantes12. Comprendre l’hétérogénéité entre différents sous-ensembles de microglies est essentiel pour étudier la pathogenèse des maladies inflammatoires démyélinisantes et trouver leurs stratégies thérapeutiques potentielles. L’hétérogénéité de la microglie dépend principalement de la spécificité moléculaire8. Il est essentiel de décrire avec précision les altérations moléculaires de la microglie pour l’étude de l’hétérogénéité. Les progrès de la technologie du séquençage de l’ARN unicellulaire (séquençage de l’ARN) ont permis d’identifier les caractéristiques moléculaires de la microglie activée dans des conditions pathologiques13. Par conséquent, la capacité d’isoler les populations cellulaires est essentielle pour une étude plus approfondie de ces cellules cibles dans des conditions spécifiques.
Les études effectuées pour comprendre les caractéristiques et les fonctions de la microglie sont généralement des études in vitro, car il a été constaté qu’un grand nombre de microglies primaires peuvent être préparées et cultivées à partir de cerveaux de chiots de souris (âgés de 1 à 3 jours), qui se fixent aux flacons de culture et se développent à la surface du plastique avec d’autres cellules gliales mélangées. Par la suite, la microglie pure peut être isolée en fonction de l’adhérence différente des cellules gliales mélangées14,15. Cependant, cette méthode ne peut isoler que la microglie du cerveau périnatal et prend plusieurs semaines. Les variables potentielles en culture cellulaire peuvent influencer les caractéristiques microgliales telles que l’expression moléculaire16. De plus, la microglie isolée par ces méthodes ne peut participer à des expériences in vitro qu’en simulant les conditions des maladies du SNC et ne peut pas représenter les caractéristiques et les fonctions de la microglie dans les états pathologiques in vivo. Par conséquent, il est nécessaire de développer des méthodes pour isoler la microglie du cerveau de la souris adulte.
Le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) et la séparation magnétique sont deux méthodes largement utilisées, bien qu’elles aient leurs propres limites 16,17,18,19. Leurs avantages et inconvénients respectifs seront mis en contraste dans la section de discussion. La maturation de la technologie MACS offre la possibilité de purifier rapidement les cellules. Huang et al. ont développé une méthode pratique pour étiqueter les lésions démyélinisantes dans le cerveau20. En combinant ces deux approches techniques, nous proposons un protocole de séparation magnétique cylindrique CD11b rapide et efficace, fournissant une description étape par étape pour isoler la microglie autour des lésions démyélinisantes dans le cerveau de souris adultes et préserver les caractéristiques moléculaires de la microglie. Les lésions démyélinisantes focales ont été causées par l’injection stéréotaxique de 2 μL de solution de lysolécithine (1% LPC dans 0,9% de NaCl) dans le corps calleux 3 jours avant le début du protocole21. Ce protocole jette les bases pour effectuer l’étape suivante dans les expériences in vitro. De plus, ce protocole permet de gagner du temps et reste réalisable pour une utilisation généralisée dans diverses expériences.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le protocole propose une méthode pour isoler la microglie autour des lésions démyélinisantes, ce qui peut aider à étudier les caractéristiques fonctionnelles de la microglie dans les maladies inflammatoires démyélinisantes. Les microglies capturées à l’aide de billes CD11b présentent une pureté et une viabilité élevées. Les étapes critiques du protocole comprennent la localisation précise des foyers et la purification microgliale optimale. Dans l’étape de protocole 2.1, il est nécessaire d’injec…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
L’étude a été soutenue par la Fondation pour un excellent jeune scientifique de l’hôpital Tongji (HUST) (subvention n ° 2020YQ06).
Materials
| 1.5 mL Micro Centrifuge Tubes | BIOFIL | CFT001015 | |
| 15 mL Centrifuge Tubes | BIOFIL | CFT011150 | |
| 50 mL Centrifuge Tubes | BIOFIL | CFT011500 | |
| 70 µm Filter | Miltenyi Biotec | 130-095-823 | |
| Adult Brain Dissociation Kit, mouse and rat | Miltenyi Biotec | 130-107-677 | |
| C57BL/6J Mice | SJA Labs | ||
| CD11b (Microglia) Beads, human and mouse | Miltenyi Biotec | 130-093-634 | |
| Fetal Bovine Serum | BOSTER | PYG0001 | |
| FlowJo | BD Biosciences | V10 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| MiniMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
| MS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Neutral Red | Sigma-Aldrich | 1013690025 | |
| NovoCyte Flow Cytometer | Agilent | A system consisting of various parts | |
| NovoExpress | Agilent | 1.4.1 | |
| PBS | BOSTER | PYG0021 | |
| Pentobarbital | Sigma-Aldrich | P-010 | |
| Stereomicroscope | MshOt | MZ62 |
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