Descriviamo un approccio per rilevare e catturare sottopopolazioni cellulari invasive in tempo reale. Il progetto sperimentale utilizza l'analisi cellulare in tempo reale monitorando i cambiamenti nell'impedenza elettrica delle cellule. Il cancro invasivo, le cellule immunitarie, endoteliali o stromali nei tessuti complessi possono essere catturati e l'impatto delle co-colture può essere valutato.
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Articolo metodologico
Rilevamento e acquisizione in tempo reale di sottopopolazioni cellulari invasive da co-colture
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'invasione e la diffusione metastatica delle cellule tumorali sono la principale causa di morte per cancro. I saggi sviluppati precocemente per misurare il potenziale invasivo delle popolazioni di cellule tumorali in genere generano una singola misurazione dell'endpoint che non distingue tra sottopopolazioni di cellule tumorali con diverso potenziale invasivo. Inoltre, il microambiente tumorale è costituito da diverse cellule stromali e immunitarie residenti che alterano e partecipano al comportamento invasivo delle cellule tumorali. L'invasione nei tessuti svolge anche un ruolo nelle sottopopolazioni di cellule immunitarie respingendo i microrganismi o eliminando le cellule malate dal parenchima e dalle cellule endoteliali durante il rimodellamento dei tessuti e l'angiogenesi. L'analisi cellulare in tempo reale (RTCA) che utilizza biosensori di impedenza per monitorare l'invasione cellulare è stato un importante passo avanti oltre la misurazione dell'invasione degli endpoint: fornisce misurazioni continue nel tempo e quindi può rivelare differenze nei tassi di invasione che vengono persi nel test dell'endpoint. Utilizzando l'attuale tecnologia RTCA, abbiamo ampliato gli array a doppia camera aggiungendo un'ulteriore camera che può contenere cellule stromali e / o immunitarie e consente di misurare il tasso di invasione sotto l'influenza di fattori secreti da cellule stromali o immunitarie co-coltivate nel tempo. Oltre a questo, il design unico consente di staccare le camere in qualsiasi momento e isolare la cellula tumorale più invasiva o altre sottopopolazioni cellulari presenti in miscele eterogenee di isolati tumorali testati. Queste cellule tumorali più invasive e altre sottopopolazioni cellulari guidano la progressione maligna verso la malattia metastatica e le loro caratteristiche molecolari sono importanti per studi meccanicistici approfonditi, lo sviluppo di sonde diagnostiche per la loro individuazione e la valutazione delle vulnerabilità. Pertanto, l'inclusione di farmaci a piccole o grandi molecole può essere utilizzata per testare il potenziale delle terapie che colpiscono il cancro e / o le sottopopolazioni di cellule stromali con l'obiettivo di inibire (ad esempio, le cellule tumorali) o migliorare (ad esempio, le cellule immunitarie) il comportamento invasivo.
Introduzione
L'invasione cellulare è un processo importante che consente alle cellule di attraversare le barriere della membrana basale in risposta ai segnali ambientali forniti dalle cellule stromali. È un passo cruciale durante diverse fasi di sviluppo per le risposte immunitarie, la guarigione delle ferite, la riparazione dei tessuti e le neoplasie maligne che possono progredire dalle lesioni locali ai tumori invasivi e metastatici1. I saggi sviluppati precocemente per misurare il potenziale invasivo delle popolazioni cellulari in genere generano una singola misurazione del punto finale o richiedono la pre-etichettatura delle cellule invasive
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Protocollo
Lo studio è stato esaminato e considerato "esente" dall'Institutional Review Board della Georgetown University (IRB # 2002-022). I tessuti del midollo osseo appena raccolti sono stati raccolti da filtri di raccolta del midollo osseo umano sano scartati che erano stati de-identificati.
1. Nuovo design della camera (Figura 2)
- Aprire una nuova piastra di analisi cellulare a doppia camera. Mettere da parte la camera superiore con gli elettrodi.
- Utilizzando una fresatrice, radere via 2 mm dei pozzetti inferiori a forma di U della piastra dell'analizzatore di cell....
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Risultati
Utilizzando l'array a tre camere di nuova concezione, l'invasione delle cellule è stata testata in presenza o assenza di cellule stromali come i fibroblasti. L'invasione cellulare MDA-MB-231 è stata potenziata quando i fibroblasti svizzeri 3T3 irradiati (ceppo J2) sono stati seminati nella camera inferiore, consentendo lo scambio di fattori tra le due linee cellulari. È interessante notare che l'invasione MDA-MB-231 è aumentata quando le cellule 3T3-J2 sono state raddoppiate in numero (Figura 3A
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Discussione
Abbiamo modificato il design di un array a doppia camera per includere una terza camera per il monitoraggio dell'invasione cellulare in tempo reale in presenza di cellule stromali. Abbiamo osservato effetti distinti dei fibroblasti co-coltivati su cellule tumorali invasive e non invasive, indicando che l'array può essere utilizzato per distinguere tra sottopopolazioni di cellule tumorali che rispondono in modo diverso ai fattori prodotti da cellule stromali co-coltivate. L'array è stato utilizzato anche per monitorare l'.......
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Dichiarazioni
La Georgetown University ha depositato un brevetto relativo ad alcuni degli approcci descritti in questo manoscritto. G.M.S, A.W, L.D e M.P sono nominati come inventori di questa applicazione e lo dichiarano come potenziale conflitto di interessi.
Ringraziamenti
Vorremmo ringraziare la dott.ssa Alana Welms, Huntsman Cancer Institute, Università dello Utah, per averci fornito gli xenotrapianti derivati dal paziente (HCI-010). Questo lavoro è stato supportato dalle sovvenzioni NIH R01CA205632, R21CA226542 e, in parte, da una sovvenzione di Agilent Technologies.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 0,05% Tripsina-EDTA | Thermofisher | 25300-054 | |
| Adesivo | Norland Optical Adhesive | NOA63 | |
| Albumina sierica bovina (BSA) | Sigma | A9418 | |
| Sollevatore cellulare | Sarstedt | 83.1832 | |
| Tossina del colera da Vibrio cholerae | Thermofisher | 12585-014 | |
| CIM-piastra | Agilent | 5665817001 | Piastra analizzatrice cellulare |
| Collagenasi da Clostridium histolyticum | Sigma | C0130 | |
| Dispase | StemCell | 7913 | |
| DMEM | Thermofisher | 11995-065 | |
| DMEM-F12 | Thermofisher | 11875-093 | |
| Siero fetale bovino (FBS), inattivato dal calore | Omega Scientific | FB-12 | |
| HEPES | Thermofisher | 15630106 | |
| Siero di cavallo (HS) | Gibco | 16050-122 | |
| EGF umano | Peprotech | AF-100-15 | |
| Cellule endotelali della vena ombelicale umana (HUVEC) | LONZA (RRID:CVCL_2959) | C-2517A | |
| HUVEC media | LONZA | CC-3162 | |
| Idrocortisone | Sigma | H4001 | |
| Insulina transferrina Selenio Etanolammina (ITSX) (100x) | Thermofisher | 51500056 | |
| insulina, ricombinante umano, soluzione di zinco | Sigma | C8052 | |
| J2 Fibroblasts | Stemcell (RRID:CVCL_W667) | 100-0353 | |
| LymphoPrep | Stemcell | 7851 | Mezzo a gradiente di densità per l'isolamento di cellule mononucleate |
| Matrigel | Corning | 354230 | a membrana basale |
| (DCIS) | RRID:CVCL_5552 | ||
| celle MDA-MB-231 | RRID:CVCL_0062 | ||
| Fresatrice | Bridgeport Serie 1 Soluzione | ||
| salina tamponata con fosfato verticale (1x) | Thermofisher | 10010049 | |
| Polietersulfone ( PES) membrana | Sterlitech | PCTF029030 | |
| soluzione di lisi dei globuli rossi | Stemcell | 7800 | |
| RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | |
| RTCA Analizzatore DP | Agilent | 3X16 | Analizzatore cellulare a doppio scopo |
| Trypsin | Sigma | T4799 |
Riferimenti
- Friedl, P., Gilmour, D. Collective cell migration in morphogenesis, regeneration and cancer. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (7), 445-457 (2009).
- Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of anti....
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Ristampe e permessi
