Utføre di vivo og ex vivo elektrisk impedans myografi hos gnagere

Summary

Denne artikkelen beskriver hvordan du utfører di vivo (ved hjelp av overflate- og nåleelektrodearrayer) og ex vivo (ved hjelp av en dielektrisk celle) elektrisk impedansmyografi på gnagermuskelen. Det vil demonstrere teknikken hos både mus og rotter og detaljere modifikasjonene som er tilgjengelige (dvs. overvektige dyr, valper).

Abstract

Elektrisk impedans myografi (EIM) er en praktisk teknikk som kan brukes i prekliniske og kliniske studier for å vurdere muskelvev helse og sykdom. EIM oppnås ved å påføre en lavintensitet, retningsfokusert, elektrisk strøm til en muskel av interesse over en rekke frekvenser (dvs. fra 1 kHz til 10 MHz) og registrere de resulterende spenningene. Fra disse oppnås flere standardimpedanskomponenter, inkludert reaktans, motstand og fase. Ved utførelse av ex vivo-målinger på skåret muskel kan vevets iboende passive elektriske egenskaper, nemlig ledningsevne og relativ permittivitet, også beregnes. EIM har blitt brukt mye hos dyr og mennesker for å diagnostisere og spore muskelendringer i en rekke sykdommer, i forhold til enkel disuse atrofi, eller som et mål for terapeutisk intervensjon. Klinisk tilbyr EIM potensialet til å spore sykdomsprogresjon over tid og å vurdere effekten av terapeutiske inngrep, og dermed gi muligheten til å forkorte varigheten av kliniske studier og redusere kravene til prøvestørrelse. Fordi det kan utføres ikke-invasivt eller minimalt invasivt i levende dyremodeller så vel som mennesker, tilbyr EIM potensialet til å tjene som et nytt translasjonsverktøy som muliggjør både preklinisk og klinisk utvikling. Denne artikkelen gir trinnvise instruksjoner om hvordan du utfører di vivo og ex vivo EIM-målinger hos mus og rotter, inkludert tilnærminger for å tilpasse teknikkene til spesifikke forhold, for eksempel for bruk hos valper eller overvektige dyr.

Introduction

Elektrisk impedansmyografi (EIM) gir en kraftig metode for å vurdere muskeltilstand, som potensielt muliggjør diagnostisering av nevromuskulære lidelser, sporing av sykdomsprogresjon og vurdering av respons på terapi ^1,2,3. Det kan brukes analogt til dyresykdomsmodeller og mennesker, noe som muliggjør relativt sømløs oversettelse fra prekliniske til kliniske studier. EIM-målinger oppnås enkelt ved hjelp av fire lineært plasserte elektroder, med de to ytre som påfører en smertefri, svak elektrisk strøm over en rekke frekvenser (vanligvis mellom 1 kHz og ca. 2 MHz), og de to indre registrerer de resulterende spenningene¹. Fra disse spenningene kan impedansegenskapene til vevet oppnås, inkludert motstanden (R), et mål på hvor vanskelig det er for strøm å passere gjennom vevet, og reaktansen (X) eller “ladningsevnen” til vevet, et mål relatert til vevets evne til å lagre ladning (kapasitans). Fra reaktansen og motstanden beregnes fasevinkelen (θ) via følgende ligning: , som gir et enkelt summativt impedansmål. Slike målinger kan oppnås ved bruk av en hvilken som helst multifrekvent bioimpedansanordning. Siden myofibre i hovedsak er lange sylindere, er muskelvev også svært anisotropt, med strøm som flyter lettere langs fibre enn over dem ^4,5. Dermed utføres EIM ofte i to retninger: med matrisen plassert langs fibrene slik at strømmen går parallelt med dem, og over muskelen slik at strømmen strømmer vinkelrett på dem. I tillegg, i ex vivo-målinger, hvor et kjent volum vev måles i en impedansmålingscelle, kan muskelens iboende elektriske egenskaper (dvs. ledningsevnen og relativ permittivitet) utledes⁶.

Begrepet “nevromuskulære lidelser” definerer et bredt spekter av primære og sekundære sykdommer som fører til strukturell muskelendring og dysfunksjon. Dette inkluderer amyotrofisk lateralsklerose og ulike former for muskeldystrofi, samt enklere endringer relatert til aldring (f.eks. Sarkopi), ubruksatrofi (f.eks. På grunn av langvarig bedrest eller mikrogravitasjon) eller til og med skade⁷. Mens årsakene er rikelig og kan stamme fra motorneuronet, nerver, nevromuskulære veikryss eller selve muskelen, kan EIM brukes til å oppdage tidlige endringer i muskelen på grunn av mange av disse prosessene og for å spore progresjon eller respons på terapi. For eksempel, hos pasienter med Duchenne muskeldystrofi (DMD), har EIM vist seg å oppdage sykdomsprogresjon og respons på kortikosteroider⁸. Nylig arbeid har også vist at EIM er følsom for varierende brukstilstander, inkludert fraksjonell tyngdekraft⁹, som det ville bli opplevd på månen eller Mars, og effekten av aldring^10,11. Til slutt, ved å bruke prediktive og maskinlæringsalgoritmer til datasettet oppnådd med hver måling (multifrekvens og retningsavhengige data), blir det mulig å utlede histologiske aspekter av vevet, inkludert myofiberstørrelse 12,13, inflammatoriske forandringer og ødem¹⁴, og bindevev og fettinnhold ^15,16.

Flere andre ikke-invasive eller minimalt invasive metoder brukes også til å evaluere muskelhelsen hos mennesker og dyr, inkludert nålelektromyografi¹⁷ og bildebehandlingsteknologier som magnetisk resonansavbildning, datastyrt tomografi og ultralyd^18,19. EIM demonstrerer imidlertid forskjellige fordeler sammenlignet med disse teknologiene. For eksempel registrerer elektromyografi bare de aktive elektriske egenskapene til myofibermembranene og ikke de passive egenskapene, og kan dermed ikke gi en sann vurdering av muskelsammensetning eller struktur. I en viss henseende er bildebehandlingsmetoder nærmere knyttet til EIM, da de også gir informasjon om strukturen og sammensetningen av vev. Men på en eller annen måte gir de for mye data, noe som krever detaljert bildesegmentering og ekspertanalyse i stedet for bare å gi en kvantitativ utgang. Dessuten, gitt deres kompleksitet, blir bildebehandlingsteknikker også sterkt påvirket av detaljene i både maskinvaren og programvaren som brukes, og krever ideelt sett bruk av identiske systemer slik at datasett kan sammenlignes. I motsetning til dette betyr det faktum at EIM er mye enklere at det er mindre påvirket av disse tekniske problemene og ikke krever noen form for bildebehandling eller ekspertanalyse.

Følgende protokoll demonstrerer hvordan man utfører di vivo EIM hos rotter og mus, ved bruk av både ikke-invasive (overflatearray) og minimalt invasive (subdermal needle array) teknikker, samt ex vivo EIM på nyskåret muskel.

Protocol

Alle metoder beskrevet her er godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee of Beth Israel Deaconess Medical Center under protokollnummer (031-2019; 025-2019). Bruk riktig PPE-utstyr for å håndtere dyr og følg IACUC-retningslinjene for alt dyrearbeid. 1. In vivo overflate EIM Plasser dyret i en anestesiboks for å indusere anestesi.MERK: For rotter ble 1,5 %-3,5 % isofluran og 2 O 2 L·min-1 brukt, og for mus ble 2 % isofluran og 1 O2 <…

Representative Results

EIM kan oppnås under mange forhold, inkludert overflate in vivo arrays (figur 1), nål in vivo arrays (figur 2A-F) og ex vivo dielektriske celler (figur 2G, H). EIM gir et nesten øyeblikkelig øyeblikksbilde av muskeltilstanden basert på de målte impedansverdiene. Målinger oppnås raskt og resulterer i en enkel utdatafil so…

Discussion

Denne artikkelen gir de grunnleggende metodene for å utføre EIM hos gnagere, både in vivo og ex vivo. For å oppnå pålitelige målinger er det viktig å utføre en rekke trinn. Først må man riktig identifisere muskelen av interesse, da hver muskel vil ha forskjellige responser på sykdommer, behandling og patologi. Man må være oppmerksom på at dataene som er oppnådd på en muskel (f.eks. Gastrocnemius) ikke vil gi samme informasjon som på en annen muskel (f.eks. Tibialis anterior). For det a…

Materials

3D Printer	Formlabs Inc.	Form 2 Desktop	3D printer
3D Printer	Shenzhen Creality 3D Technology Co. LTD	Creality Ender 3 V2	3D printer
3M Micropore surgical tape	Fisher	19-027761 and 19-061655	models 1530-0 and 1530-1
3M TRANSPORE surgical tape	Fisher	18-999-380 and 18-999-381	models 1527-0 and 1527-1
Connector header vertical 10 POS 1 mm spacing	Digi-Key (Sullins connector solution)	S9214-ND (SMH100-LPSE-S10-ST-BK)	Plastic spacer 1 mm holes for the rat in vivo array displayed in Figure 2A
Cotton-tipped applicators	Fisher	22-363-172
Dental Wax	Fisher	NC9377103
Depilatory agent	NAIR	NA	hair remover lotion with softening baby oil
Dumont #7b Forceps	Fine Science Tools	No. 11270-20	Used for dissection, Style: #7b, Tip Shape: Curved, Tips: Standard, Tip Dimensions: 0.17 mm x 0.1 mm, Alloy/Material: Inox, Length: 11 cm
Electronic Digital Caliper	Fisher	14-648-17	Used to measure out the dimensions of the Gastrocnemius muscle
Epoxy adhesive dual cartridge 4 min work life	Devcon	series 14265, model 2217	Glue used in the rat in vivo array displayed in Figure 2A
Ex vivo dielectric impedance cell	Custom	NA	Dielectric cells were 3D printed in the Rutkove laboratory
Graefe Forceps	Fine Science Tools	No. 11051-10	Used for muscle to place and adjust, Length: 10 cm, Tip Shape: Curved, Tips: Serrated, Tip Width: 0.8 mm, Tip Dimensions: 0.8 mm x 0.7 mm, Alloy/Material
Hair clipper	Amazon	NA	Wahl professional animal BravMini+
Impedance Animal Device	Myolex	EIM1103	mView system – investigational electrical impedance myography device for use in animal research
In vivo needle arrays	Custom	NA	Custom arrays using 27 G subdermal needles from Ambu. The construction was finalized using a 3D printer in the Rutkove laboratory
In vivo surface array	Custom	NA	The in vivo surface array was printed and assembled in the Rutkove laboratory
Isoflurane	Patterson Veterinary Supplies	07-893-8441 (NDC: 46066-755-04)	Pivetal – 250 mL bottle
Non-woven gauze	Fisher	22-028-559	2 x 2 inch
Polystyrene Weighing Dishes	Fisher	S67090A	Dimensions (L x W x H): 88.9 mm x 88.9 mm x 25.4 mm
Razor Blades	Fisher	12-640	Used to cut muscle to right dimensions, Single-edge carbon steel blades
Student Fine Scissors	Fine Science Tools	No. 91460-11	Used for dissection, Tips: Sharp-Sharp, Alloy/Material: Student Stainless Steel, Serrated: No, Tip Shape: Straight, Cutting Edge: 20 mm, Length: 11.5 cm, Feature: Student Quality
Subdermal needles 27 G Neuroline	Ambu	745 12-50/24	Needles used in the rat in vivo array displayed in Figure 2A
Surgical Scissors – Sharp	Fine Science Tools	No. 14002-13	Used to cut skin, Tips: Sharp-Sharp, Alloy/Material: Stainless Steel, Serrated: No, Tip Shape: Straight, Cutting Edge: 42 mm, Length: 13 cm
TECA ELITE monopolar needle electrodes	Natus	902-DMG50-S	0.46 mm diameter (26 G). Blue hub
Teknova 0.9% saline solution	Fisher	S5815	1000 mL sterile