सैकरीना लैटिसिमा के भ्रूण में लक्षित लेजर पृथक्करण
Summary
भ्रूण में विशिष्ट कोशिकाओं का विनाश सेल भाग्य में शामिल सेलुलर इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है। वर्तमान प्रोटोकॉल भूरे रंग के शैवाल सैचरीना लैटिसिमा के शुरुआती भ्रूण में लक्षित कोशिकाओं के लेजर पृथक्करण के लिए तकनीकों का वर्णन करता है।
Abstract
सैकरीना लैटिसिमा में, भ्रूण एक मोनोलेयर्ड सेल शीट के रूप में विकसित होता है जिसे लैमिना या ब्लेड कहा जाता है। प्रत्येक भ्रूण कोशिका का निरीक्षण करना आसान है, आसानी से अपने पड़ोसियों से अलग है, और व्यक्तिगत रूप से लक्षित किया जा सकता है। दशकों से, भ्रूण के विकास का अध्ययन करने के लिए लेजर पृथक्करण का उपयोग किया गया है। यहां, भूरे रंग के शैवाल एस लैटिसिमा के शुरुआती भ्रूण के लिए सेल-विशिष्ट लेजर पृथक्करण के लिए एक प्रोटोकॉल विकसित किया गया था। प्रस्तुत कार्य में शामिल हैं: (1) संस्कृति की स्थिति सहित महत्वपूर्ण मापदंडों के विवरण के साथ सैकरीना भ्रूण की तैयारी, (2) लेजर पृथक्करण सेटिंग्स, और (3) समय-चूक माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके विकिरणित भ्रूण के बाद के विकास की निगरानी। इसके अलावा, इमेजिंग प्लेटफॉर्म से प्रयोगशाला में भ्रूण के परिवहन के लिए इष्टतम स्थितियों पर विवरण प्रदान किए जाते हैं, जो बाद के भ्रूण के विकास को गहराई से प्रभावित कर सकते हैं। आदेश लामिनारियल्स से संबंधित शैवाल सैकरीना के समान भ्रूणजनन पैटर्न प्रदर्शित करते हैं; इस प्रोटोकॉल को इस प्रकार इस टैक्सोन में अन्य प्रजातियों में आसानी से स्थानांतरित किया जा सकता है।
Introduction
भ्रूण के विकास का अध्ययन करने के लिए दशकों से लेजर पृथक्करण का उपयोग किया गया है। लेजर बीम के साथ भ्रूण कोशिकाओं को विकिरणित करना पुनर्योजी क्षमता और भ्रूणजनन के दौरान कोशिका वंश के संशोधन की निगरानी करना और कोशिका विभाजन और कोशिका भाग्य पर लक्षित पृथक्करण के प्रभाव की जांच करना संभव बनाता है। लेजर पृथक्करण विधियों में उपयोग किए जाने वाले मॉडल जीव आमतौर पर जानवर होते हैं, जैसे कीड़े 1,2, नेमाटोड 3,4, कशेरुक 5,6, और कभी-कभी पौधे 7,8। इसके अलावा, प्रारंभिक भ्रूण 9,10 के फोटोपोलराइजेशन में सेल की दीवार की भूमिका को प्रदर्शित करने के लिए 1994 और 1998 में भूरे रंग के शैवाल फुकस पर एक लेजर माइक्रो-एब्लेशन दृष्टिकोण का उपयोग किया गया था।
ब्राउन शैवाल स्ट्रैमेनोपाइल समूह से संबंधित हैं, जो 1.6 बिलियन साल पहले यूकेरियोटिक पेड़ की जड़ में अलग हो गए थे। नतीजतन, वे अन्य बहुकोशिकीय जीवों, जैसे जानवरों और पौधों से फाइटोलैनेटिक रूप से स्वतंत्र हैं11. सैकरिना लैटिसिमा लैमिनारियल्स के क्रम से संबंधित है, जिसे आमतौर पर केल्प्स के रूप में जाना जाता है, और वे पृथ्वी पर सबसे बड़े जीवों में से हैं, जो 30 मीटर से अधिक के आकार तक पहुंचते हैं सैकरीना एसपी एक बड़ा समुद्री शैवाल है जिसका उपयोग भोजन और फ़ीड जैसे कई अनुप्रयोगों के लिए किया जाता है, और इसके पॉलीसेकेराइड दुनिया भर में कृषि, औषधीय और कॉस्मेटिक उद्योगों में उपयोग के लिए निकाले जाते हैं12, 13. इसकी खेती, मुख्य रूप से एशिया में और हाल ही में यूरोप में, खुले समुद्र में किशोरों को छोड़ने से पहले हैचरी में भ्रूण की तैयारी की आवश्यकता होती है। सभी केल्प्स की तरह, इसमें एक सूक्ष्म गैमेटोफाइटिक चरण से बना एक द्विध्रुवीय जीवन चक्र होता है, जिसके दौरान एक अगुणित गैमेटोफाइट बढ़ता है और निषेचन के लिए युग्मक पैदा करता है, और एक द्विगुणित मैक्रोस्कोपिक स्पोरोफाइटिक चरण, जहां एक बड़ा प्लानर ब्लेड सीफ्लोर या चट्टानों से जुड़े अपने होल्डफास्ट से विकसित होता है। स्पोरोफाइट परिपक्वता पर अगुणित बीजाणुओं को छोड़ता है, जिससे जीवन चक्र 14,15,16 पूरा होता है।
एस लैटिसिमा कुछ दिलचस्प रूपात्मक विशेषताएं प्रस्तुत करता है17. इसका भ्रूण विभिन्न ऊतक प्रकारों के उद्भव के साथ मेल खाने वाली बहुस्तरीय संरचना प्राप्त करने से पहले एक मोनोलेयर्ड प्लानर शीट 15,18,19 के रूप में विकसित होता है। इसके अलावा, लैमिनारियल्स भूरे शैवाल के एकमात्र कर में से एक है जिसका भ्रूण अपने मातृ गैमेटोफाइटिक ऊतक से जुड़ा रहता है (डेसमेस्ट्रेस्टियल्स और स्पोरोचनेल्स बहुत15 करते हैं)। यह सुविधा इस विकास प्रक्रिया में मातृ ऊतक की भूमिका का अध्ययन करने और जानवरों और पौधों के साथ भूरे शैवाल में मातृ नियंत्रण तंत्र की तुलना करने का अवसर प्रदान करती है।
यह लेख प्रारंभिक केल्प भ्रूण में लेजर पृथक्करण के लिए पहला पूर्ण प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है। यूवी एनएस-स्पंदित तकनीक से जुड़े इस प्रोटोकॉल के परिणामस्वरूप भ्रूणजनन के दौरान उनकी संबंधित भूमिकाओं का अध्ययन करने के लिए व्यक्तिगत भ्रूण कोशिकाओं का विशिष्ट विनाश होता है। प्रक्रिया लामिनारियल्स में भ्रूणजनन के दौरान सेल इंटरैक्शन और सेल भाग्य की जांच के लिए एक विश्वसनीय दृष्टिकोण प्रदान करती है।
Protocol
Representative Results
Discussion
स्थानीय सेलुलर लेजर पृथक्करण परिशुद्धता के एक उच्च स्तर के साथ अस्थायी और स्थानिक पृथक्करण के लिए अनुमति देता है। हालांकि, इसकी दक्षता लक्ष्य कोशिकाओं की गैर-पहुंच से बाधित हो सकती है; उदाहरण के लिए, स?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
एसबी के पीएचडी अनुदान को क्षेत्र ब्रेटाग्ने (एआरईडी अनुदान संख्या सीओएच 20020) और सोरबोन यूनिवर्सिटी द्वारा वित्त पोषित किया जाता है। I.T.is पीएचडी अनुदान क्षेत्र ब्रेटाग्ने (एआरईडी अनुदान संख्या सीओएच 18020) और नॉर्वेजियन एनएमबीयू विश्वविद्यालय द्वारा वित्त पोषित है। इस परियोजना को एमआईटीआई अंतःविषय कार्यक्रमों के माध्यम से सीएनआरएस से वित्तीय सहायता मिली है। एमआरआईसी फ्रेंच नेशनल रिसर्च एजेंसी (एएनआर -10-आईएनबीएस -04) द्वारा समर्थित राष्ट्रीय बुनियादी ढांचे फ्रांस-बायोइमेजिंग का सदस्य है।
Materials
| 25 mm glass bottom petri dish | NEST | 801001 | |
| Autoclaved sea water | – | Collected offshore near the Astan buoy (48°44.934 N 003°57.702 W) close to Roscoff, France, at a depth of 20 m. | |
| Cell scraper | MED 2 | 83.3951 | |
| Cell strainer 40 µm | Corning / Falcon | 352340 | |
| Culture cabinets | Snijders Scientific Plant Growth Cabinet ECD01 | Any other brand is suitable provided that the light intensity, the photoperiod and the temperature can be controlled. | |
| LSM 880 Zeiss confocal microscope | Carl Zeiss microscopy, Jena, Germany | Ablation and imaging were performed using a 40x/1.2 water objective | |
| Pellet pestles | Sigma Aldrich | Z359947 | Blue polypropylene (autoclavable) |
| Provasoli supplement | – | Recipe is available here: http://www.sb-roscoff.fr/sites/www.sb-roscoff.fr/files/documents/station-biologique-roscoff-preparation-du-provasoli-2040.pdf | |
| Pulsed 355 laser (UGA-42 Caliburn 355/25) | Rapp OptoElectronic, Wedel, Germany | ||
| Scalpel | Paramount | PDSS 11 | |
| SysCon software | Rapp OptoElectronic, Wedel, Germany | Laser-driver software | |
| ZEN software | Carl Zeiss microscopy, Jena, Germany | Imaging software, used together with the SysCon software; Black 2.3 version |
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