Microdisseção de camada de folhetos de válvulas tricúsplicas para caracterização mecânica biaxial e quantificação microestrutural
Summary
Este protocolo descreve a caracterização mecânica biaxial, quantificação de colágeno baseada em imagens de frequência espacial polarizada e microdisseção de folhetos de válvula tricúspide. O método fornecido elucida como as camadas de folhetos contribuem para os comportamentos holísticos do folheto.
Abstract
A válvula tricúspide (TV) regula o fluxo unidirecional de sangue não desoxorado do átrio direito ao ventrículo direito. A TV é composta por três folhetos, cada um com comportamentos mecânicos únicos. Essas variações entre os três folhetos de TV podem ser ainda mais compreendidas examinando suas quatro camadas anatômicas, que são as atrialis (A), esponjosa (S), fibrosa (F) e ventricularis (V). Embora essas camadas estejam presentes nos três folhetos de TV, há diferenças em suas espessuras e constituintes microestruturais que influenciam ainda mais seus respectivos comportamentos mecânicos.
Este protocolo inclui quatro etapas para elucidar as diferenças específicas da camada: (i) caracterizar os comportamentos arquitetônicos de fibra mecânica e colágeno do folheto de TV intacto, (ii) separar as camadas compostas (A/S e F/V) do folheto de TV, (iii) realizar as mesmas caracterizações para as camadas compostas, e (iv) realizar pós-hoc avaliação histologia. Esta estrutura experimental permite exclusivamente a comparação direta do tecido de TV intacto com cada uma de suas camadas compostas. Como resultado, informações detalhadas sobre a microestrutura e a função biomecânica dos folhetos de TV podem ser coletadas com este protocolo. Essas informações podem potencialmente ser usadas para desenvolver modelos computacionais de TV que buscam fornecer orientação para o tratamento clínico da doença da TV.
Introduction
A TV está localizada entre o átrio direito e o ventrículo direito do coração. Ao longo do ciclo cardíaco, a TV regula o fluxo sanguíneo unidirecional através da abertura cíclica e fechamento do folheto anterior da TV (TVAL), do folheto posterior da TV (TVPL) e do folheto septal da TV (TVSL). Esses folhetos são complexos e têm quatro camadas anatômicas distintas — as atrialis (A), a esponjosa (S), a fibrosa (F) e a ventricular (V)— com constituintes microestruturais únicos. As fibras de elastina nos atrialis e ventricularis ajudam a restaurar o tecido à sua geometria não deformada após o carregamento mecânico1. Em contraste, a fibrosa contém uma densa rede de fibras de colágeno onduladas que contribuem para a capacidade de carga dos folhetos2. Consistindo principalmente de gllicosaminoglicanos, a esponngue foi hipótese para permitir a tesoura entre camadas de folheto durante a função da válvula cardíaca3. Embora todos os três tipos de folhetos tenham as mesmas camadas anatômicas, há variações nas espessuras das camadas e proporções constituintes que têm implicações para comportamentos mecânicos específicos de folhetos.
Pesquisadores têm explorado as propriedades dos folhetos de TV usando caracterizações mecânicas planar, avaliações histomorfológicas e caracterizações ópticas da arquitetura de fibra de colágeno. Por exemplo, caracterizações mecânicas biaxiais planar buscam emular o carregamento fisiológico aplicando deslocamentos perpendiculares ao tecido e registrando as forças associadas. As observações resultantes de deslocamento de força (ou estiramento de estresse) revelaram que todos os três folhetos de TV apresentam comportamentos mecânicos não lineares e específicos da direção com respostas mais aparentes específicas do folheto na direçãodo tecido radial 4,5,6. Acredita-se que esses comportamentos específicos de folhetos decorrem de diferenças nas propriedades microestruturais observadas utilizando técnicas histológicas padrão 6,7. Além disso, a imagem de segunda geração harmônica6, a dispersão de luz de pequeno ângulo8 e a imagem de domínio de frequência espacial polarizada7 (pSFDI) visam entender essas propriedades microestruturais e têm mostrado diferenças específicas de folhetos na orientação da fibra de colágeno e no crimp de fibras que têm implicações para os comportamentos mecânicos observados no nível do tecido. Esses estudos avançaram significativamente nossa compreensão da microestrutura tecidual e seu papel em comportamentos de nível tecidual. No entanto, ainda há muito a ser abordado na conexão experimental da mecânica tecidual e da microestrutura subjacente.
Recentemente, este laboratório realizou caracterizações mecânicas das camadas de folhetos de TV separadas em duas camadas compostas (A/S e F/V) utilizando uma técnica de microdisseção9. Esse trabalho anterior destacou diferenças nas propriedades mecânicas das camadas e ajudou a fornecer insights sobre como a microestrutura em camadas contribui para os comportamentos mecânicos do tecido. Embora essa investigação tenha melhorado nossa compreensão da microestrutura do folheto de TV, a técnica tinha várias limitações. Em primeiro lugar, as propriedades das camadas compostas não foram diretamente comparadas com o tecido intacto, levando à falta de compreensão completa da relação mecânica-microestrutura. Em segundo lugar, a arquitetura de fibra de colágeno das camadas compostas não foi examinada. Em terceiro lugar, apenas as camadas da TVAL foram investigadas devido a dificuldades na coleta das camadas compostas dos outros dois folhetos de TV. O método descrito aqui fornece um quadro de caracterização holística que supera essas limitações e fornece caracterizações completas dos folhetos de TV e suas camadas compostas.
Este artigo descreve a técnica de microdisseção que separa os três folhetos de TV em suas camadas compostas (A/S e F/V) para caracterizações mecânicas e microestruturais biaxiais 10,11,12. Este protocolo iterativo inclui (i) testes mecânicos biaxiais e caracterização pSFDI do folheto intacto, (ii) uma técnica de microdissecção nova e reprodutível para obter de forma confiável as camadas de TV composta, e (iii) testes mecânicos biaxial e caracterização pSFDI das camadas de TV compostas. O tecido foi exposto ao carregamento de tração biaxial com várias razões de força para testes mecânicos. Em seguida, o pSFDI foi usado para determinar a orientação e alinhamento da fibra de colágeno em várias configurações carregadas. o pSFDI preserva a arquitetura nativa da fibra de colágeno, permite análises dependentes de carga e contorna a necessidade típica de fixar ou limpar tecido para análise de arquitetura de fibra de colágeno, como em imagens de segunda geração harmônica ou dispersão de luz de pequeno ângulo. Finalmente, os tecidos foram preparados utilizando técnicas padrão de histologia para visualizar a microestrutura tecidual. Esta estrutura iterativa e holística permite a comparação direta das propriedades mecânicas e microestruturais do folheto de TV com suas camadas compostas.
Protocol
Representative Results
Discussion
As etapas críticas para o protocolo incluem: (i) a microdisseção da camada, (ii) a montagem do tecido, (iii) a colocação do marcador fiducial e (iv) a configuração pSFDI. A microdisseção de camada apropriada é o aspecto mais importante e difícil do método aqui descrito. Antes de iniciar uma investigação utilizando essa técnica, o dissector(s) deve ter prática de longo prazo com a técnica de microdisseção e todos os três folhetos de TV. O dissetor deve garantir que as amostras de camada composta sejam …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pela American Heart Association Scientist Development Grant (16SDG27760143) e pela Presbyterian Health Foundation. O KMC foi apoiado em parte pelo Programa de Oportunidade de Pesquisa de Graduação da Universidade de Oklahoma (OU) e pelo Programa de Aprendizagem de Pesquisa de Honras da Universidade de Oklahoma (OU). A DWL foi apoiada em parte pela National Science Foundation Graduate Research Fellowship (GRF 2019254233) e pela American Heart Association/Children’s Heart Foundation Predoctoral Fellowship (Prêmio #821298). Todo esse apoio é reconhecido com gratidão.
Materials
| 10% Formalin Solution, Neutral Buffered | Sigma-Aldrich | HT501128-4L | |
| Alconox Detergent | Alconox | cleaning compound | |
| BioTester – Biaxial Tester | CellScale Biomaterials Testing | 1.5 N Load Cell Capacity | |
| Cutting Mat | Dahle | B0027RS8DU | |
| Deionized Water | N/A | ||
| Fine-Tipped Tool | HTI INSTRUMENTS | NSPLS-12 | |
| Forceps – Curved | Scientific Labwares | 16122 | |
| Forceps – Thick | Scientific Labwares | 161001078 | |
| Forceps – Thin | Scientific Labwares | 16127 | |
| LabJoy | CellScale Biomaterials Testing | Version 10.66 | |
| Laser Displacement Sensor | Keyence | IL-030 | |
| Liquid Cyanoacrylate Glue | Loctite | 2436365 | |
| MATLAB | MathWorks | Version 2020a | |
| Micro Scissors | HTI Instruments | CAS55C | |
| Pipette | Belmaks | 360758081051Y4 | |
| Polarized Spatial Frequency Domain Imaging Device | N/A | Made in-house using a digital light projector, linear polarizer, rotating polarizer mount, and charge-coupled device camera. See doi.org/10.1016/j.actbio.2019.11.028 (PMCID: PMC8101699) for more details. |
|
| Scalpel | THINKPRICE | TP-SCALPEL-3010 | |
| Single Edge Industrial Razor Blades (Surgical Carbon Steel) | VWR International | H3515541105024 | |
| Surgical Pen | LabAider | LAB-Skin-6 | |
| T-Pins | Business Source | BSN32351 | |
| Wax Board | N/A | Made in-house using modeling wax and baking tray | |
| Weigh Boat | Pure Ponta | mdo-azoc-1030 |
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