Amplifikation af Escherichia coli i en kontinuerlig-flow-PCR mikrofluidisk chip og dens påvisning med et kapillærelektroforesesystem
Summary
Denne protokol beskriver, hvordan man bygger et kontinuerligt flowpolymerasekædesystem baseret på en mikrofluidisk chip, og hvordan man bygger et kapillærelektroforesesystem i laboratoriet. Det præsenterer en enkel metode til analyse af nukleinsyrer i laboratoriet.
Abstract
Polymerasekædereaktion (PCR) er en traditionel metode, der anvendes til amplifikation af et målgen, der har spillet en vigtig rolle i biomolekylær diagnostik. Imidlertid er traditionel PCR meget tidskrævende på grund af variationseffektiviteten ved lave temperaturer. Dette arbejde foreslår et kontinuerligt-flow-PCR (CF-PCR) system baseret på en mikrofluidisk chip. Forstærkningstiden kan reduceres kraftigt ved at køre PCR-opløsningen i en mikrokanal placeret på varmeapparater, der er indstillet til forskellige temperaturer. Da kapillærelektroforese (CE) desuden er en ideel måde at differentiere positive og falsk-positive PCR-produkter på, blev der bygget et CE-system for at opnå effektiv adskillelse af DNA-fragmenterne. Dette papir beskriver processen med amplifikation af Escherichia coli (E. coli) ved hjælp af CF-PCR-systemet, der er indbygget internt, og påvisning af PCR-produkterne ved CE. Resultaterne viser, at målgenet for E. coli blev amplificeret med succes inden for 10 minutter, hvilket indikerer, at disse to systemer kan bruges til hurtig amplifikation og påvisning af nukleinsyrer.
Introduction
Polymerasekædereaktion (PCR) er en molekylærbiologisk teknik, der bruges til at amplificere specifikke DNA-fragmenter og derved forstærke spormængder af DNA hundreder af millioner af gange. Det har været meget udbredt i klinisk diagnose, medicinsk forskning, fødevaresikkerhed, retsmedicinsk identifikation og andre områder. PCR-processen består hovedsageligt af tre trin: denaturering ved 90-95 °C, udglødning ved 50-60 °C og forlængelse ved 72-77 °C. Termisk cykling er en vigtig del af PCR-processen; Den traditionelle termiske PCR-cyklist er dog ikke kun omfangsrig, men også ineffektiv og kræver ca. 40 minutter at gennemføre 25 cyklusser. For at overvinde disse begrænsninger blev der bygget et kontinuerligt flow PCR (CF-PCR) system internt baseret på en mikrofluidisk chip. CF-PCR kan i høj grad spare tid ved at køre PCR-opløsningen ind i mikrokanaler placeret på varmeapparater ved forskellige temperaturer 1,2,3,4,5.
Da kapillærelektroforese (CE) har mange fordele, såsom høj opløsning, høj hastighed og fremragende reproducerbarhed 6,7,8,9,10,11, er det blevet et populært værktøj i laboratoriet til analyse af nukleinsyrer og proteiner. Imidlertid har de fleste laboratorier, især laboratorier i udviklingslandene, ikke råd til denne teknologi på grund af den høje pris på CE-instrumentet. Heri har vi skitseret protokoller for, hvordan man fremstiller CF-PCR-mikrofluidisk chip, og hvordan man bygger et alsidigt CE-system i laboratoriet. Vi demonstrerer også processen med amplifikation af E. coli ved hjælp af dette CF-PCR-system og CE-systemets påvisning af PCR-produkter. Ved at følge procedurerne beskrevet i denne protokol bør brugerne være i stand til at fremstille mikrofluidiske chips, forberede PCR-opløsninger, opbygge et CF-PCR-system til nukleinsyreamplifikation og oprette et simpelt CE-system, selv med begrænsede ressourcer, til at adskille DNA-fragmenter.
Protocol
Representative Results
Discussion
Både PCR og CE er to populære bioteknologier i analysen af nukleinsyrer. Dette papir beskriver forstærkningen af E. coli og påvisningen af PCR-produkterne ved hjælp af CF-PCR- og CE-systemerne, begge bygget internt. Målgenet for E. coli blev amplificeret inden for 10 minutter på grund af de høje varmeoverførselshastigheder. DNA-fragmenterne mindre end 1.500 bp blev adskilt inden for 8 minutter (figur 5). Den store fordel ved disse to teknikker er, at det i høj gra…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af Science and Technology Commission of Shanghai Municipality, Kina (nr. 19ZR1477500 og nr. 18441900400). Vi anerkender taknemmeligt økonomisk støtte fra University of Shanghai for Science and Technology (No.2017KJFZ049).
Materials
| 100 bp DNA ladder | Takara Bio Inc. | 3422A | |
| 10x Fast Buffer I | Takara Bio Inc. | RR070A | |
| 10x TBE | Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd. | T1051 | |
| developer solution | Alfa Aesar, USA | L15459 | |
| dNTP mixture (2.5 μM) | Takara Bio Inc. | RR070A | |
| EC-F | Sangon Biotech, Shanghai, China | ||
| EC-R | Sangon Biotech, Shanghai, China | ||
| HEC,1300K | Sigma-Aldrich, USA | 9004-62-0 | |
| isopropanol | Aladdin, Shanghai, China | 67-63-0 | |
| microscope | Olympus, Japan | BX51 | |
| photolithography | SUSS MicroTec, Germany | MJB4 | |
| photomultiplier tube | Hamamatsu Photonics, Japan | R928 | |
| photoresist | MicroChem, USA | SU-8 2075 | |
| PID temperature controllers | Shanghai, China | XH-W2023 | |
| plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G-2 | |
| polyvinyl pyrrolidone (PVP) | Aladdin, Shanghai, China | P110608 | |
| pump | Harvard Apparatus | PHD2000 | |
| silicone tubing | BIO-RAD,USA | 7318210 | |
| solid-state relays | KZLTD, China | KS1-25LA | |
| SpeedSTAR HS DNA Polymerase | Takara Bio Inc. | RR070A | |
| steel needle | zhongxinqiheng,Suzhou,China | ||
SYBR GREEN  |
Solarbio, Beijing, China | SY1020 | |
| temperature sensors | EasyShining Technology, Chengdu, China | TCM-M207 | |
| Template (E. coli) | Takara Bio Inc. | AK601 | |
| Tween 20 | Aladdin, Shanghai, China | T104863 | |
| voltage power supply | Medina, NY, USA | TREK MODEL 610E |
Riferimenti
- Li, Z., et al. All-in-one microfluidic device for on-site diagnosis of pathogens based on an integrated continuous flow PCR and electrophoresis biochip. Lab on a Chip. 19 (16), 2663-2668 (2019).
- Crews, N., Wittwer, C., Gale, B. Continuous-flow thermal gradient PCR. Biomedical Microdevices. 10 (2), 187-195 (2008).
- Li, Z., et al. Design and fabrication of portable continuous flow PCR microfluidic chip for DNA replication. Biomedical Microdevices. 22 (1), 5 (2019).
- Kim, J. A., et al. Fabrication and characterization of a PDMS-glass hybrid continuous-flow PCR chip. Biochemical Engineering Journal. 29 (1-2), 91-97 (2006).
- Shen, K., Chen, X., Guo, M., Cheng, J. A microchip-based PCR device using flexible printed circuit technology. Sensors and Actuators B: Chemical. 105 (2), 251-258 (2005).
- Harstad, R. K., Johnson, A. C., Weisenberger, M. M., Bowser, M. T. Capillary Electrophoresis. Analytical Chemistry. 88 (1), 299-319 (2016).
- Redman, E. A., Mellors, J. S., Starkey, J. A., Ramsey, J. M. Characterization of intact antibody drug conjugate variants using microfluidic capillary electrophoresis-mass spectrometry. Analytical Chemistry. 88 (4), 2220-2226 (2016).
- Britz-Mckibbin, P., Kranack, A. R., Paprica, A., Chen, D. D. Quantitative assay for epinephrine in dental anesthetic solutions by capillary electrophoresis. Analyst. 123 (7), 1461-1463 (1998).
- Maeda, H., et al. Quantitative real-time PCR using TaqMan and SYBR Green for Actinobacillus actinomycetemcomitans, Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermedia, tetQgene and total bacteria. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 39 (1), 81-86 (2003).
- Hajba, L., Guttman, A. Recent advances in column coatings for capillary electrophoresis of proteins. TrAC Trends in Analytical Chemistry. 90, 38-44 (2017).
- Kleparnik, K. Recent advances in combination of capillary electrophoresis with mass spectrometry: methodology and theory. Electrophoresis. 36 (1), 159-178 (2015).
