チベットミニブタの駆出率が保たれた心不全の外科的モデル
Summary
本プロトコルは、下行大動脈狭窄を使用して駆出率を維持した心不全のミニブタモデルを確立するための段階的な手順を記述する。また、この疾患モデルの心臓の形態、組織型、および機能を評価する方法も紹介します。
Abstract
心不全(HF)症例の半数以上は、世界中で駆出率保持型心不全(HFpEF)に分類されています。HFpEFの基本的なメカニズムを調査し、潜在的な治療標的を特定するための大型動物モデルは限られています。この研究は、HFpEFの大型動物モデルを確立するために、チベットのミニブタにおける下行大動脈狭窄(DAC)の外科的処置の詳細な説明を提供します。このモデルは、下行大動脈の狭窄を正確に制御して、左心室の慢性的な圧力過負荷を誘発しました。心エコー検査は、心臓の形態学的および機能的変化を評価するために使用されました。DACストレスの12週間後、心室中隔は肥大したが、左心室の拡張を伴って後壁の厚さは有意に減少した。しかし、モデル心臓のLV駆出率は、12週間の間、>50%に維持された。さらに、DACモデルでは、線維化、炎症、心筋細胞肥大などの心臓障害が認められました。心不全マーカーレベルはDAC群で有意に上昇した。このDAC誘導性HFpEFは、この疾患の分子メカニズムの調査や前臨床試験のための強力なツールです。
Introduction
駆出率が保たれた心不全(HFpEF)は、心不全症例の半数以上を占めており、世界的な公衆衛生上の問題となっています1。臨床観察では、HFpEFのいくつかの重要な特徴が示されています:(1)収縮期硬化の増加を伴う心室拡張期機能障害、(2)運動能力の低下を伴う安静時の正常駆出率、および(3)心臓リモデリング2。提案されたメカニズムには、ホルモン調節不全、全身性微小血管炎症、代謝障害、およびサルコメアおよび細胞外マトリックスタンパク質の異常が含まれます3。しかし、実験的研究は、駆出率の低下を伴う心不全(HFrEF)がこれらの変化を引き起こすことを示しています。臨床研究では、アンジオテンシン受容体阻害剤とHFpEFのHFrEF治療薬の治療効果が調査されています4,5。しかし、HFpEFには独自の治療法が必要です。臨床症状の理解と比較すると、HFpEFの病理学、生化学、および分子生物学の変化は十分に定義されていません。
HFpEFの動物モデルは、そのメカニズム、診断マーカー、および治療アプローチを探求するために開発されています。ブタ、イヌ、ラット、マウスなどの実験動物はHFpEFを発症する可能性があり、高血圧、糖尿病、老化など多様な危険因子を誘導因子として選択しました6,7。例えば、酢酸デオキシコルチコステロン単独または高脂肪/高糖質飼料と組み合わせると、豚にHFpEFが誘導されます8,9。心室圧過負荷は、大動物および小動物モデルでHFpEFを発症するために使用される別の技術です10。また、欧州心臓病学会のガイドライン、米国心臓病学会財団/米国心臓協会11、日本循環器学会/日本心不全学会12に見られるように、近年、HFpEFを定義するための特定のEFカットオフ値が大陸を超えて採用されています。したがって、臨床基準が採用されれば、以前に確立された多くのモデルがHFpEF研究に適している可能性があります。例えば、Youselfiらは、遺伝子改変マウス系統Col4a3-/-が有効なHFpEFモデルであると主張した。この株は、拡張期機能障害、ミトコンドリア機能障害、心臓リモデリングなどの典型的なHFpEF心臓症状を発症した13。以前の研究では、高エネルギー食を使用して、代謝障害、線維症、および心筋のアクトミオシンMgATPaseの減少を特徴とする高齢のサル14で中程度のEFによる心臓リモデリングを誘発しました。マウス横大動脈狭窄術(TAC)は、高血圧誘発性心室性心筋症を模倣するために最も広く使用されているモデルの1つです。左心室は、EFの増加を伴う同心円状の肥大から、EF15,16の減少を伴う拡張型リモデリングへと進行する。これら2つの典型的な病期の間の移行表現型は、大動脈狭窄法を使用してHFpEFを研究できることを示唆しています。
ブタHFpEFモデルの病理学的特徴、細胞シグナル伝達、およびmRNAプロファイルは、以前に発表されています17。ここでは、このモデルを確立するためのステップバイステップのプロトコルと、このモデルの表現型を評価するためのアプローチを示します。この手順を 図 1 に示します。簡単に言うと、手術計画は、主任研究者、外科医、検査技師、および動物ケアスタッフによって共同で作成されました。ミニブタは、生化学検査や心エコー検査などの健康診断を受けました。手術後、抗炎症薬と鎮痛薬の処置が行われました。心エコー検査、組織学的検査、およびバイオマーカーを使用して表現型を評価しました。
Protocol
Representative Results
Discussion
本研究では、DAC技術を用いて、チベットミニブタのHFpEFモデルを開発しました。ここでは、鎮静、気管挿管、静脈カニューレ挿入、外科的処置、術後ケアなど、動物および器具の準備手順を段階的に説明します。また、心エコー検査のBモードおよびMモードの心臓画像の記録技術についても紹介します。DAC後、心臓は4週目と6週目に左心室肥大を起こし、8週目以降に拡張しました。LVEFは12週間…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
本研究は、広東省科学技術プログラム(2008A08003、2016A020216019、2019A030317014)、広州科学技術プログラム(201804010206)、中国国家自然科学基金会(31672376、81941002)、広東省実験動物重点実験室(2017B030314171)の支援を受けて行われました。
Materials
| Absorbable surgical suture | Putong Jinhua Medical Co. Ltd, China | 4-0 | |
| Aesthesia ventilator station | Shenzhen Mindray Bio-Medical Electronics Co., Ltd, China | WATO EX-35vet | |
| Aspirator | Shanghai Baojia Medical Apparatus Co., Ltd, China | YX930D | |
| Benzylpenicillin | Sichuan Pharmaceutical. INC, China | H5021738 | |
| Disposal endotracheal tube with cuff | Shenzhen Verybio Co., Ltd, China | 20 cm, ID 0.9 | |
| Disposal transducer | Guangdong Baihe Medical Technology Co., Ltd, China | ||
| Dissection blade | Shanghai Medical Instruments (Group) Co., Ltd, China | ||
| Electrocautery | Shanghai Hutong Medical Instruments (Group) Co., Ltd, China | GD350-B | |
| Enzyme-linked immunosorbent assay ELISA kit | Cusabio Biotech Co., Ltd, China | CSB-E08594r | |
| Eosin | Sigma-Aldrich Corp. | E4009 | |
| Flunixin meglumine | Shanghai Tongren Pharmaceutical Co., Ltd., China | Shouyaozi(2012)-090242103 | |
| Forceps | Shanghai Medical Instruments (Group) Co., Ltd.,China | ||
| Hematoxylin | Sigma-Aldrich Corp. | H3136 | |
| Isoflurane | RWD Life Science Co., Ltd, China | Veteasy for animals | |
| Laryngoscope | Taixing Simeite Medical Apparatus and Instruments Limited Co., Ltd, China | For adults | |
| LED surgical lights | Mingtai Medical Group, China | ZF700 | |
| Microplate reader | Thermo Fisher Scientific, USA | Multiskan FC | |
| Microscope | Leica, Germany | DM2500 | |
| Mobile restraint unit | Customized | N/A | A mobile restraint unit, made by metal frame and wheels, with a canvas cover |
| Oxygen | Local suppliers, Guangzhou, China | ||
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich Corp. | V900894 | |
| Patient monitor | Shenzhen Mindray Bio-Medical Electronics Company, China | Beneview T5 | |
| Peripheral Intravenous (IV) Catheter | Shenzhen Yima Pet Industry Development Co., Ltd., China | 26G X 16 mm | |
| Propofol | Guangdong Jiabo Phamaceutical Co., Ltd. | H20051842 | |
| Rib retractor | Shanghai Medical Instruments (Group) Co., Ltd.,China | ||
| Ruler | Deli Manufacturing Company, China | ||
| Scalpel handles | Shanghai Medical Instruments (Group) Co., Ltd.,China | ||
| Scissors (g) | Shanghai Medical Instruments (Group) Co., Ltd.,China | ||
| Suture | Medtronic-Coviden Corp. | 3-0, 4-0 | |
| Ultrasonic gel | Tianjin Xiyuansi Production Institute, China | TM-100 | |
| Veterinary monitor | Shenzhen Mindray Bio-Medical Electronics Company, China | ePM12M Vet | |
| Veterinary ultrasound system | Esatoe, Italy | MyLab30 | Equiped with phased array transducer (3-8 Hz) |
| Xylazine hydrochloride injection | Shenda Animal Phamarceutical Co., Ltd., China | Shouyaozi(2016)-07003 | |
| Zoletil injection | Virbac, France | Zoletil 50 | Tiletamine and zolazepam for injection |
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