الإعطاء تحت الملتحمة لنواقل الفيروسات المرتبطة بالغدة في نماذج الحيوانات الصغيرة
Summary
في هذه المخطوطة، يتم توضيح الحقن تحت الملتحمة كطريقة صالحة لتوصيل النواقل لأنسجة العين في الفئران باستخدام نظام حقن يتكون من مضخة حقنة تسريب/سحب وحقنة قابلة للإزالة محكمة الإغلاق مقترنة بإبر الحقن المجهري. نظام الحقن هذا قابل للتكيف أيضا مع طرق إدارة العين الأخرى.
Abstract
تشمل أمراض العين مجموعة واسعة من الاضطرابات الوراثية والمكتسبة التي تعد أهدافا جذابة لتوصيل الأدوية المحلية نظرا لسهولة الوصول إليها نسبيا عبر طرق إدارة متعددة. توفر الحقن تحت الملتحمة (SCJ) مزايا مقارنة بطرق الإدارة داخل العين الأخرى لأنها بسيطة وآمنة وعادة ما يتم إجراؤها في العيادات الخارجية. عادة ما تتطلب حقن SCJ في الحيوانات الصغيرة مساعدة مجهر التشغيل بسبب حجم العين. أظهرت الأعمال السابقة أن حقن SCJ لأنماط مصلية محددة مرتبطة بالفيروس الغدي (AAV) هو استراتيجية صالحة لتوصيل الجينات للنقل المستهدف لسطح العين وعضلة العين والقرنية والعصب البصري ، مما يوفر نهجا محتملا لعلاج العديد من أمراض العين.
هنا ، يتم تقديم بروتوكول مفصل لحقن SCJ في نموذج الماوس باستخدام نظام حقن يتكون من مضخة حقنة قابلة للبرمجة / السحب (والتي تسمح بسرعة وضغط حقن متسقة ودقيقة) وحقنة قابلة للإزالة محكمة الغاز إلى جانب إبر الحقن المجهري. نظام الحقن قابل للتكيف أيضا مع طرق الإدارة الأخرى داخل العين مثل الحقن داخل اللحمة وداخل الكاميرا وداخل الجسم الزجاجي وتحت الشبكية في الحيوانات الصغيرة. على الرغم من وصف توصيل النواقل الفيروسية المرتبطة بالغدي لدراسات العلاج الجيني للعين ، يمكن أيضا تكييف البروتوكول هنا لمجموعة متنوعة من حلول العيون في نماذج الحيوانات الصغيرة. ستتم مناقشة الخطوات العملية الرئيسية في مسار الإدارة ، وإعداد منصة الحقن ، وإعداد الحقن ، ونصائح من التجربة المباشرة بالتفصيل. بالإضافة إلى ذلك ، سيتم أيضا مناقشة تقنيات التحقق الشائعة لتأكيد تسليم AAV إلى الأنسجة المطلوبة بإيجاز.
Introduction
تشمل أمراض العين مجموعة واسعة من الاضطرابات الوراثية والمكتسبة. في عام 2015، كان ما يقدر بنحو 36 مليون شخص يعانون من العمى القانوني في جميع أنحاء العالم، ويعاني أكثر من مليار شخص من مستوى معين على الأقل من ضعف البصر، مما يسلط الضوء على الحاجة إلى توسيع نطاق جهود التخفيف على جميع المستويات1. تشمل الطرق الرئيسية لتوصيل أدوية العين كلا من الإدارة الموضعية والمحلية ، مثل قطرات العين أو الحقن تحت الملتحمة (SCJ) ، والحقن داخل الكاميرا ، داخل الجسم الزجاجي ، وتحت الشبكية. على الرغم من أن العلاج الموضعي غير الباضع هو طريقة التوصيل الأكثر شيوعا لأدوية العيون ويستخدم على نطاق واسع للعديد من اضطرابات الجزء الأمامي ، فإن وجود حواجز تشريحية للقرنية يمثل تحديا للتوافر البيولوجي والتوزيع الحيوي وفعالية المواد المدارة موضعيا ، مما يشير إلى أنه قد لا يكون أفضل طريق علاج مرشح للعديد من أمراض العين الداخلية. من المرجح أن يكون الحقن الموضعي في حجرة العين المحددة المتأثرة بالمرض نهجا أكثر فعالية واستهدافالتوصيل الدواء 2. ومع ذلك ، فإن الآثار الضارة الناتجة عن الحقن المتكررة يمكن أن تعقد استراتيجيات الإدارة. من الناحية المثالية ، يجب أن يحافظ العلاج على فعالية علاجية طويلة الأجل بعد إدارة واحدة. وبالتالي ، يعد العلاج الجيني خيارا واعدا لتقليل عدد الحقن المطلوبة وتوفير تعبير جيني محوري مستدام لعلاج مرض العين 3,4.
تتوفر العديد من النواقل الفيروسية وغير الفيروسية للعلاج الجيني. ومع ذلك ، فإن ناقلات AAV ذات أهمية كبيرة بسبب ملف تعريف السلامة الممتاز. AAV هو فيروس DNA صغير ، تقطعت به السبل ، غير مغلف تم اكتشافه في البداية كملوث لإعداد الفيروس الغدي في عام 1965 بواسطة Atchison et al.5,6 تم تصميم AAV لاحقا كناقل فيروسي فعال لتوصيل الجينات في 1980s وأصبح ناقل العلاج الجيني المفضل للعديد من الأمراض ، بما في ذلك اضطرابات العين ، على مدى العقود القليلة الماضية. أبرزها هو أول دواء للعلاج الجيني متاح تجاريا ، voretigene neparvovec ، والذي تمت الموافقة عليه من قبل إدارة الغذاء والدواء الأمريكية لعلاج داء ليبر الخلقي ، وهو مرض نادر في العين الخلفية. على الرغم من أن voretigene neparvovec قد تغلب بنجاح على الحواجز التي تحول دون التطوير السريري ، إلا أنه لا تزال هناك تحديات أمام تسويق علاجات جينية إضافية للعين. على سبيل المثال ، يتم إعطاء voretigene neparvovec للمرضى الذين يحتفظون بخلايا شبكية قابلة للحياة عن طريق الحقن تحت الشبكية. وبالتالي ، فإن المرضى الذين يعانون من أشكال أكثر تقدما من المرض والذين يفتقرون إلى خلايا شبكية قابلة للحياة غير مؤهلين للعلاج ، لأنه لن يوفر أي فائدة سريرية. بالإضافة إلى ذلك ، لوحظت مضاعفات معروفة مرتبطة بإجراء الحقن تحت الشبكية ، بما في ذلك التهاب العين ، إعتام عدسة العين ، تمزق الشبكية ، اعتلال البقعة ، والألم 7,8. تشمل المخاوف الأخرى المتعلقة بهذا الإجراء إمكانية حدوث نزيف ، وانفصال الشبكية ، والتهاب باطن المقلة ، وإلغاء حالة امتياز المناعة العينية من خلال تدمير أنسجة العين9،10،11،12. وبالتالي ، أصبحت الجهود المبذولة لاستكشاف طرق توصيل الجينات الأقل توغلا مثل حقن SCJ ذات أهمية متزايدة13،14،15،16،17.
الملتحمة عبارة عن غشاء رقيق يحتوي على 3-5 طبقات من الخلايا ويربط العين الأمامية بالجفن الداخلي. تستخدم حقن SCJ سريريا لتوصيل أدوية العيون إلى كل من الأجزاء الأمامية و / أو الخلفية من العين لعلاج أمراض العين مثل الضمور البقعي المرتبط بالعمر ، والزرق ، والتهاب الشبكية ، والتهاب القزحية الخلفي18,19. إنها بسيطة نسبيا في الأداء ، وتستخدم بشكل روتيني لتوصيل أدوية العيون في العيادات الخارجية20 ، غير مؤلمة إلى حد ما ، ولا تضر بامتياز المناعة العينية ، وتسمح للأدوية المعطاة بالانتشار عبر منطقة كبيرة حول الحجاج تشمل العصب البصري. وبالتالي ، فإن حقن SCJ هي طريقة جذابة للإعطاء لتطبيقات العلاج الجيني AAV. تم سابقا وصف الأنماط المصلية الطبيعية AAV التي يتم إعطاؤها عن طريق حقن SCJ في الفئران من أجل السلامة وكفاءة النقل ومناعة المصل والتوزيع الحيوي وخصوصية الأنسجة13،16،21. أظهرت هذه البيانات أن توصيل الجينات إلى أنسجة العين الفردية عن طريق إدارة SCJ هو احتمال رسمي.
تصف هذه الورقة بروتوكولا بسيطا وقابلا للتكيف لحقن SCJ لتقديم متجهات AAV في نموذج ماوس. لضمان استنساخ هذا النهج ، تم وصف نظام حقن يتكون من مجهر مجسم ، ومضخة حقنة قابلة للبرمجة بالتسريب / السحب (والتي تسمح بسرعة وضغط حقن متسقة ودقيقة) ، وحقنة قابلة للإزالة محكمة الغلق مقترنة بإبر الحقن المجهري. هذا النظام قابل للتكيف مع طرق الإدارة داخل العين الأخرى مثل الحقن داخل اللحمة وداخل الكاميرا وداخل الجسم الزجاجي وتحت الشبكية في الحيوانات الصغيرة. بالإضافة إلى ذلك ، غالبا ما يتم استخدام صبغة الفلوريسئين للسماح بتصور موقع حقن AAV. ستتم مناقشة الخطوات العملية الرئيسية في مسار الإدارة ، وإعداد منصة الحقن ، وإعداد الحقن ، ونصائح من التجربة المباشرة بالتفصيل. أخيرا ، ستتم مناقشة تقنيات التحقق الشائعة لتأكيد تسليم AAV إلى الأنسجة المطلوبة بإيجاز.
Protocol
Representative Results
Discussion
يحمل العلاج الجيني بوساطة AAV إمكانات كبيرة لعلاج أمراض العين. يعتمد العلاج الجيني العيني الحالي على طريقين رئيسيين للإدارة المحلية ، الحقن داخل الجسم الزجاجي وتحت الشبكية. لسوء الحظ ، كلا الطريقين غازيان ويمكن أن يسببان مضاعفات خطيرة ، بما في ذلك انفصال الشبكية وتشكيل إعتام عدسة العين وا?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يشكر المؤلفون Vector Core في جامعة نورث كارولينا على توفير ناقلات scAAV8-GFP المستخدمة في هذه الدراسة ، و CGIBD Coistology Core ، ومختبر الدكتور Brian C. Gilger لمساعدتهم في جوانب التقييم السريري لهذه الدراسة. تم دعم هذه الدراسة من قبل زمالة ما بعد الدكتوراه المتميزة في Pfizer-NC Biotech وجائزة التطوير الوظيفي من الجمعية الأمريكية للعلاج الجيني والخلوي ومؤسسة التليف الكيسي. المحتوى هو مسؤولية المؤلفين فقط ولا يمثل بالضرورة الآراء الرسمية للجمعية الأمريكية للعلاج الجيني والخلوي أو مؤسسة التليف الكيسي.
Materials
| 36 G NanoFil Needles | World Precision Instruments | NF36BV-2 | |
| AAV vector | University of North Carolina at Chapel Hill | / | |
| Acepromazine | Henry Schein | NDC 11695-0079-8 | |
| anti-GFP antibody | AVES labs Inc. | ||
| Digital camera | Cannon | Cannon EOS T5i | |
| DNA/RNA extraction kit | Qiagen | 80204 | |
| Forceps | Fine Science Tools | F6521 | |
| Hamilton syringe | Hamilton | 7654-01 | |
| India ink | StatLab | NC9903975 | |
| Ketamine hydrochloride injection solution | Henry Schein | NDC 0409-2051-05 | |
| Moisture-resistant film | Parafilm | 807-6 | |
| Polyethylene tubing | Becton Dickinson and Company | 427401 | |
| Proparacaine 0.1% | Bausch Health US | NDC 24208-730-06 | |
| Rebound tonometer | Tonovet | / | |
| Sodium fluorescein solution | Sigma-Aldich | 46960 | |
| Standard Infuse/Withdraw Pump 11 Pico Plus Elite Programmable Syringe Pump | Harvard Bioscience | 70-4504 | |
| Stereo microscopye | Leica | Mz6 | |
| Tetracaine Hydrochloride Ophthalmic Solution 0.5% | Bausch and Lomb | Rx only | |
| Topical ointment | GenTeal | NDC 0078-0429-47 | |
| Xylazine | Akorn | NDC 59399-110-20 | |
| Zone-Quick Phenol Red Thread Box 100 Threads | ZONE-QUICK | PO6448 |
Riferimenti
- Bourne, R. R. A., et al. Magnitude, temporal trends, and projections of the global prevalence of blindness and distance and near vision impairment: a systematic review and meta-analysis. The Lancet Global Health. 5 (9), 888-897 (2017).
- Swetledge, S., Jung, J. P., Carter, R., Sabliov, C. Distribution of polymeric nanoparticles in the eye: implications in ocular disease therapy. Journal of Nanobiotechnology. 19 (1), 10 (2021).
- Petit, L., Khanna, H., Punzo, C. Advances in gene therapy for diseases of the eye. Humam Gene Therapy. 27 (8), 563-579 (2016).
- Russell, S., et al. Efficacy and safety of voretigene neparvovec (AAV2-hRPE65v2) in patients with RPE65-mediated inherited retinal dystrophy: a randomised, controlled, open-label, phase 3 trial. Lancet. 390 (10097), 849-860 (2017).
- Atchison, R. W., Casto, B. C., Hammon, W. M. Adenovirus-associated defective virus particles. Science. 149 (3685), 754-756 (1965).
- Atchison, R. W., Casto, B. C., Hammon, W. M. Electron microscopy of adenovirus-associated virus (AAV) in cell cultures. Virology. 29 (2), 353-357 (1966).
- Peng, Y., Tang, L., Zhou, Y. Subretinal injection: a review on the novel route of therapeutic delivery for vitreoretinal diseases. Ophthalmic Research. 58 (4), 217-226 (2017).
- Gaudana, R., Jwala, J., Boddu, S. H., Mitra, A. K. Recent perspectives in ocular drug delivery. Pharmacological Research. 26 (5), 1197-1216 (2009).
- Amado, D., et al. Safety and efficacy of subretinal readministration of a viral vector in large animals to treat congenital blindness. Science Translational Medicine. 2 (21), (2010).
- Li, Q., et al. Intraocular route of AAV2 vector administration defines humoral immune response and therapeutic potential. Molecular Vision. 14, 1760-1769 (2008).
- Ausayakhun, S., Yuvaves, P., Ngamtiphakom, S., Prasitsilp, J. Treatment of cytomegalovirus retinitis in AIDS patients with intravitreal ganciclovir. Journal of Medical Association of Thailand. 88, 15-20 (2005).
- Miyadera, K., et al. Intrastromal gene therapy prevents and reverses advanced corneal clouding in a canine model of mucopolysaccharidosis I. Molecular Therapy. 28 (6), 1455-1463 (2020).
- Song, L., et al. Serotype survey of AAV gene delivery via subconjunctival injection in mice. Gene Therapy. 25 (6), 402-414 (2018).
- Cheng, H. C., Yeh, S. I., Tsao, Y. P., Kuo, P. C. Subconjunctival injection of recombinant AAV-angiostatin ameliorates alkali burn induced corneal angiogenesis. Molecular Vision. 13, 2344-2352 (2007).
- Veneziale, R. W., et al. SCH 412499: biodistribution and safety of an adenovirus containing P21(WAF-1/CIP-1) following subconjunctival injection in Cynomolgus monkeys. Cutaneous and Ocular Toxicology. 26 (2), 83-105 (2007).
- Liu, G. S., et al. Gene delivery by subconjunctival injection of adenovirus in rats: a study of local distribution, transgene duration and safety. PLoS One. 10 (12), 0143956 (2015).
- Igarashi, T., et al. Direct comparison of administration routes for AAV8-mediated ocular gene therapy. Current Eye Research. 38 (5), 569-577 (2013).
- Gaudana, R., Ananthula, H. K., Parenky, A., Mitra, A. K. Ocular drug delivery. AAPS Journal. 12 (3), 348-360 (2010).
- Short, B. G. Safety evaluation of ocular drug delivery formulations: techniques and practical considerations. Toxicologic Pathology. 36 (1), 49-62 (2008).
- Stevens, S. Administering a subconjunctival injection. Community Eye Health. 22 (69), 15 (2009).
- Song, L., Bower, J. J., Hirsch, M. L. Preparation and administration of adeno-associated virus vectors for corneal gene delivery. Methods in Molecular Biology. 2145, 77-102 (2020).
- de Vries, V. A., Bassil, F. L., Ramdas, W. D. The effects of intravitreal injections on intraocular pressure and retinal nerve fiber layer: a systematic review and meta-analysis. Scientific Reports. 10 (1), 13248 (2020).
- Hartman, R. R., Kompella, U. B. Intravitreal, subretinal, and suprachoroidal injections: evolution of microneedles for drug delivery. Journal of Ocular Pharmacology and Theraputics. 34 (1-2), 141-153 (2018).
- Nuzzi, R., Scalabrin, S., Becco, A. Reduction of intraocular pressure spikes due to intravitreal bevacizumab injections by scleral indentation with cotton swab or digital ocular massage: innovative techniques compared. Clinical Ophthalmology. 14, 2533-2541 (2020).
- Crabtree, E., et al. AAV-mediated expression of HLA-G1/5 reduces severity of experimental autoimmune uveitis. Scientific Reports. 9 (1), 19864 (2019).
- Song, L., et al. Gene delivery to human limbal stem cells using viral vectors. Human Gene Therapy. 30 (11), 1336-1348 (2019).
- Reichel, M. B., et al. New model of conjunctival scarring in the mouse eye. British Journal of Ophthalmology. 82 (9), 1072-1077 (1998).
- Barnard, A. R., Rudenko, A. N., MacLaren, R. E. Vector shedding and immunogenicity sampling for retinal gene therapy. Methods in Molecular Biology. 1715, 359-371 (2018).
- Gilger, B. C., et al. A fixed-depth microneedle enhances reproducibility and safety for corneal gene therapy. Cornea. 39 (3), 362-369 (2020).
- Cheruvu, N. P., Kompella, U. B. Bovine and porcine transscleral solute transport: influence of lipophilicity and the Choroid-Bruch’s layer. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 47 (10), 4513-4522 (2006).
