Administração Subconjuntival de Vetores de Vírus Adenoassociados em Modelos de Pequenos Animais

Summary

Neste manuscrito, a injeção subconjuntival é demonstrada como um método de entrega vetorial válido para tecidos oculares em camundongos usando um sistema de injeção que consiste em uma bomba de seringa de infusão/retirada e uma seringa removível à prova de gás acoplada a agulhas de microinjeção. Este sistema de injeção também é adaptável para outras vias de administração intraocular.

Abstract

As doenças oculares incluem uma ampla gama de distúrbios genéticos e adquiridos hereditários que são alvos atraentes para a administração local de medicamentos devido à sua relativa facilidade de acessibilidade através de várias vias de administração. As injeções subconjuntivais (SCJ) oferecem vantagens em relação a outras vias de administração intraocular, pois são simples, seguras e geralmente realizadas em ambiente ambulatorial. As injeções de SCJ em pequenos animais geralmente requerem a assistência de um microscópio cirúrgico devido ao tamanho do olho. Trabalhos anteriores demonstraram que a injeção de SCJ de sorotipos específicos de vírus adenoassociados (AAV) é uma estratégia válida de entrega de genes para transdução direcionada da superfície ocular, músculo ocular, córnea e nervo óptico, fornecendo uma abordagem potencial para o tratamento de muitas doenças oculares.

Neste documento, um protocolo detalhado é apresentado para injeções SCJ em um modelo de camundongo usando um sistema de injeção que consiste em uma bomba de seringa de infusão/retirada programável (que permite velocidade e pressão de injeção consistentes e precisas) e uma seringa removível à prova de gás acoplada a agulhas de microinjeção. O sistema de injeção também é adaptável para outras vias de administração intraocular, como injeções intraestromais, intracamerais, intravítreas e sub-retinianas em pequenos animais. Embora a entrega de vetores virais adenoassociados para estudos de terapia gênica ocular seja descrita, o protocolo aqui também pode ser adaptado para uma variedade de soluções oftálmicas em pequenos modelos animais. As principais etapas práticas na via de administração, configuração para a plataforma de injeção, preparação da injeção e dicas da experiência direta serão discutidas em detalhes. Além disso, técnicas comuns de validação para a confirmação da entrega de AAV aos tecidos desejados também serão brevemente discutidas.

Introduction

As doenças oculares abrangem uma ampla gama de distúrbios genéticos e adquiridos. Em 2015, estima-se que 36 milhões de pessoas eram legalmente cegas em todo o mundo e mais de 1 bilhão de pessoas sofrem de pelo menos algum nível de deficiência visual, destacando a necessidade de ampliar os esforços de alívio em todos os níveis¹. Os principais métodos para a administração de medicamentos oculares incluem administração tópica e local, como colírios ou injeções subconjuntivais (SCJ), intracamerais, intravítreas e sub-retinianas. Embora a terapia tópica não invasiva seja o método de administração mais comum para drogas oftálmicas e seja amplamente utilizada para muitos distúrbios do segmento anterior, a presença de barreiras anatômicas da córnea apresenta um desafio para a biodisponibilidade, biodistribuição e eficácia de substâncias administradas topicamente, sugerindo que pode não ser a melhor via de tratamento candidata para muitas doenças do olho interno. A injeção local no compartimento ocular específico afetado pela doença provavelmente será uma abordagem de liberação de medicamentos mais eficaz e direcionada². No entanto, os efeitos adversos resultantes de injeções repetidas podem complicar as estratégias de administração. Idealmente, uma terapia deve manter a eficácia terapêutica a longo prazo após uma única administração. Assim, a terapia gênica é uma opção promissora para minimizar o número de injeções necessárias e proporcionar expressão transgênica sustentada para o tratamento da doença ocular ^3,4.

Numerosos vetores virais e não virais estão disponíveis para terapia gênica; no entanto, os vetores AAV são de alto interesse devido ao seu excelente perfil de segurança. O AAV é um vírus de DNA pequeno, de fita simples e não envelopado, que foi inicialmente descoberto como contaminante de uma preparação de adenovírus em 1965 por Atchison et ^{al.5,6 O} AAV foi posteriormente modificado como um vetor viral eficiente para a entrega de genes na década de 1980 e tornou-se o vetor de terapia gênica de escolha para muitas doenças, incluindo distúrbios oculares, ao longo das últimas décadas. O mais notável deles é o primeiro medicamento de terapia genética comercialmente disponível, o voretigene neparvovec, que foi aprovado pela Food and Drug Administration dos Estados Unidos para tratar a Amaurose Congênita de Leber, uma doença ocular posterior rara. Embora o voretigene neparvovec tenha superado com sucesso as barreiras ao desenvolvimento clínico, ainda existem desafios para a comercialização de terapias genéticas oculares adicionais. Por exemplo, o voretigene neparvovec é administrado a doentes que retêm células viáveis da retina através de injeção sub-retiniana. Assim, pacientes com formas mais avançadas da doença que não possuem células retinianas viáveis não são elegíveis para o tratamento, pois não proporcionaria nenhum benefício clínico. Além disso, complicações conhecidas associadas ao procedimento de injeção sub-retiniana foram observadas, incluindo inflamação ocular, catarata, lacrimejamento da retina, maculopatia e dor ^7,8. Outras preocupações relacionadas a esse procedimento incluem a possibilidade de hemorragia, descolamento de retina, endoftalmite e revogação do estado imune privilegiado ocular por meio da destruição do tecido ocular 9,10,11,12. Assim, os esforços para explorar rotas de entrega de genes menos invasivas, como a injeção de SCJ, têm se tornado cada vez mais importantes 13,14,15,16,17.

A conjuntiva é uma membrana fina contendo 3-5 camadas de células e conectando o olho anterior à pálpebra interior. As injeções de SCJ são usadas clinicamente para a administração oftálmica de drogas nos segmentos anterior e/ou posterior do olho para o tratamento de doenças oculares, como degeneração macular relacionada à idade, glaucoma, retinite e uveíte posterior^18,19. Eles são relativamente simples de serem realizados, empregados rotineiramente para a administração de medicamentos oftálmicos em ambiente ambulatorial²⁰, um pouco indolores, não comprometem o privilégio imunológico ocular e permitem que os medicamentos administrados se espalhem por uma grande região periorbital que engloba o nervo óptico. Assim, as injeções de SCJ são uma via atraente de administração para aplicações de terapia gênica AAV. Os sorotipos naturais de AAV administrados por injeção de SCJ em camundongos foram previamente caracterizados quanto à segurança, eficiência de transdução, imunogenicidade sérica, biodistribuição e especificidade tecidual^13,16,21. Estes dados demonstraram que a entrega de genes a tecidos oculares individuais através da administração de SCJ é uma possibilidade formal.

Este artigo descreve um protocolo simples e adaptável para injeção de SCJ para fornecer vetores AAV em um modelo de camundongo. Para garantir a reprodutibilidade desta abordagem, é descrito um sistema de injeção constituído por um estereomicroscópio, uma bomba de seringa de infusão/retirada programável (que permite uma velocidade e pressão de injeção consistentes e precisas) e uma seringa removível à prova de gás acoplada a agulhas de microinjeção. Este sistema é adaptável para outras vias de administração intraocular, como injeções intraestromais, intracamerais, intravítreas e sub-retinianas em pequenos animais. Além disso, um corante fluoresceína é frequentemente utilizado para permitir a visualização do local de injeção de AAV. As principais etapas práticas na via de administração, configuração para a plataforma de injeção, preparação da injeção e dicas da experiência direta serão discutidas em detalhes. Finalmente, técnicas comuns de validação para confirmação da entrega de AAV aos tecidos desejados serão brevemente discutidas.

Protocol

Todos os procedimentos em animais foram realizados de acordo com os regulamentos do Comitê Institucional de Cuidado e Uso de Animais da Universidade da Carolina do Norte em Chapel Hill. O uso de vetores AAV é um risco de biossegurança Nível 1. Use equipamentos de proteção individual adequados, incluindo um jaleco, luvas e óculos de proteção ao manusear o AAV. Para o experimento aqui descrito, foi utilizado um vetor AAV recombinante embalado com o capsídeo do sorotipo 8 e codificando um promotor genérico de cit…

Representative Results

A solução injetada no espaço subconjuntival apresenta-se como uma bolha dependendo do volume de injeção.Neste experimento, 7 μL de AAV (7 × 109 genomas virais (vg)/olho) misturados com fluoresceína na concentração final de 0,1% foram injetados com uma agulha de 36 G sob estereomicroscópio, e a velocidade/pressão de injeção foi mantida constante usando uma bomba de seringa programável a 1 μL/s. Uma bolha pode aparecer após a injeção (seta). Uma visão microscópica da adm…

Discussion

A terapia genética mediada por AAV tem um grande potencial para o tratamento de doenças oculares. A terapia genética ocular atual depende de duas vias principais de administração local, injeções intravítreas e sub-retinianas. Infelizmente, ambas as vias são invasivas e podem causar sérias complicações, incluindo descolamento de retina, formação de catarata e endoftalmite. Assim, a investigação de vias relativamente menos invasivas, como a injeção de SCJ, é de grande interesse.

<p class="jove_conten…

Materials

36 G NanoFil Needles	World Precision Instruments	NF36BV-2
AAV vector	University of North Carolina at Chapel Hill	/
Acepromazine	Henry Schein	NDC 11695-0079-8
anti-GFP antibody	AVES labs Inc.
Digital camera	Cannon	Cannon EOS T5i
DNA/RNA extraction kit	Qiagen	80204
Forceps	Fine Science Tools	F6521
Hamilton syringe	Hamilton	7654-01
India ink	StatLab	NC9903975
Ketamine hydrochloride injection solution	Henry Schein	NDC 0409-2051-05
Moisture-resistant film	Parafilm	807-6
Polyethylene tubing	Becton Dickinson and Company	427401
Proparacaine 0.1%	Bausch Health US	NDC 24208-730-06
Rebound tonometer	Tonovet	/
Sodium fluorescein solution	Sigma-Aldich	46960
Standard Infuse/Withdraw Pump 11 Pico Plus Elite Programmable Syringe Pump	Harvard Bioscience	70-4504
Stereo microscopye	Leica	Mz6
Tetracaine Hydrochloride Ophthalmic Solution 0.5%	Bausch and Lomb	Rx only
Topical ointment	GenTeal	NDC 0078-0429-47
Xylazine	Akorn	NDC 59399-110-20
Zone-Quick Phenol Red Thread Box 100 Threads	ZONE-QUICK	PO6448