Lokalisering av enkeltcellefaktor på kromatin ved hjelp av ultra-lav inngangsspalting under mål og frigjøring ved hjelp av nuklease
Summary
CUT&RUN og dens varianter kan brukes til å bestemme protein belegg på kromatin. Denne protokollen beskriver hvordan du bestemmer proteinlokalisering på kromatin ved hjelp av encellet uliCUT&RUN.
Abstract
Å bestemme bindingsstedene til et protein på kromatin er avgjørende for å forstå funksjonen og potensielle regulatoriske mål. Kromatin immunoprecipitation (ChIP) har vært gullstandarden for å bestemme proteinlokalisering i over 30 år og er definert ved bruk av et antistoff for å trekke ut proteinet av interesse fra sonikert eller enzymatisk fordøyd kromatin. Mer nylig har antistoff tethering teknikker blitt populært for å vurdere protein lokalisering på kromatin på grunn av deres økte følsomhet. Cleavage Under Targets &release Under Nuclease (CUT&RUN) er det genom-brede derivatet av Kromatin Immunocleavage (ChIC) og benytter rekombinant protein A bundet til mikrokokkkjerne (pA-MNase) for å identifisere IgG konstant region av antistoffet rettet mot et protein av interesse, og muliggjør derfor stedsspesifikk spalting av DNA-flanken av proteinet av interesse. CUT&RUN kan brukes til å profilere histone modifikasjoner, transkripsjonsfaktorer og andre kromatinbindende proteiner som nukleosom ombyggingsfaktorer. Det er viktig at CUT&RUN brukes til å vurdere lokaliseringen av enten eukromatiske eller heterokromatiske assosierte proteiner og histone modifikasjoner. Av disse grunnene er CUT&RUN en kraftig metode for å bestemme bindingsprofilene til et bredt spekter av proteiner. Nylig har CUT&RUN blitt optimalisert for transkripsjonsfaktorprofilering i lave populasjoner av celler og enkeltceller, og den optimaliserte protokollen har blitt kalt ultra-lav input CUT&RUN (uliCUT&RUN). Her presenteres en detaljert protokoll for encellet faktorprofilering ved hjelp av uliCUT&RUN i et manuelt 96-brønns format.
Introduction
Mange kjerneproteiner fungerer ved å samhandle med kromatin for å fremme eller forhindre DNA-malaktiviteter. For å bestemme funksjonen til disse kromatin-interagerende proteinene, er det viktig å identifisere de genomiske stedene der disse proteinene er bundet. Siden utviklingen i 1985 har Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) vært gullstandarden for å identifisere hvor et protein binder seg til kromatin 1,2. Den tradisjonelle ChIP-teknikken har følgende grunnleggende arbeidsflyt: celler høstes og krysskobles (vanligvis med formaldehyd), kromatin skjæres (vanligvis med harde sonikeringsmetoder, nødvendig krysskobling), proteinet av interesse er immunoprecipitated ved hjelp av et antistoff som retter seg mot proteinet (eller merket protein) etterfulgt av et sekundært antistoff (koblet til agarose eller magnetiske perler), krysskobling er reversert, protein og RNA fordøyes for å rense DNA, og dette ChIP-beriket-DNA brukes som mal for analyse (ved hjelp av radiomerkede sonder 1,2, qPCR3, mikroarrays 5,6 eller sekvensering4). Med fremkomsten av mikroarrays og massivt parallell dyp sekvensering har ChIP-chip 5,6 og ChIP-seq4 nylig blitt utviklet og muliggjør genomomfattende identifisering av proteinlokalisering på kromatin. Crosslinking ChIP har vært en kraftig og pålitelig teknikk siden adventen med store fremskritt i oppløsning av ChIP-exo7 og ChIP-nexus8. Parallelt med utviklingen av ChIP-seq er det etablert innfødte (ikke-krysskoblingsprotokoller) for ChIP (N-ChIP), som bruker nuklease fordøyelse (ofte ved hjelp av mikrokokkkjerne eller MNase) for å fragmentere kromatinet, i motsetning til sonikering utført i tradisjonelle krysskoblings ChIP-teknikker9. Imidlertid har en stor ulempe med både krysskobling av ChIP- og N-ChIP-teknologier vært kravet til høye celletall på grunn av lavt DNA-utbytte etter eksperimentell manipulasjon. Derfor har mange de siste årene vært rettet mot å optimalisere ChIP-teknologier for lavcelleinndata. Dette arbeidet har resultert i utviklingen av mange kraftige ChIP-baserte teknologier som varierer i deres anvendbarhet og inngangskrav 10,11,12,13,14,15,16,17,18. Imidlertid har encellede ChIP-seq-baserte teknologier manglet, spesielt for ikke-histone proteiner.
I 2004 ble det utviklet en alternativ teknologi for å bestemme proteinbelegg på kromatin kalt Chromatin Endogenous Cleavage (ChEC) og Chromatin Immunocleavage (ChIC)19. Disse enkelt-locus teknikker bruker en fusjon av MNase til enten protein av interesse (ChEC) eller til protein A (ChIC) for direkte kutting av DNA ved siden av protein av interesse. I de senere år har både ChEC og ChIC blitt optimalisert for genomomfattende proteinprofilering på kromatin (henholdsvis ChEC-seq og CUT&RUN)20,21. Mens ChEC-seq er en kraftig teknikk for å bestemme faktorlokalisering, krever det å utvikle MNase-fusjonsproteiner for hvert mål, mens ChIC og dens genomomfattende variasjon, CUT&RUN, er avhengig av et antistoff rettet mot proteinet av interesse (som med ChIP) og rekombinant Protein A-MNase, hvor Protein A kan gjenkjenne IgG konstant region av antistoffet. Som et alternativ er det utviklet et fusjonsprotein A /Protein G-MNase (pA/G-MNase) som kan gjenkjenne et bredere spekter av antistoffkonstantregioner22. CUT&RUN har raskt blitt et populært alternativ til ChIP-seq for å bestemme proteinlokalisering på kromatingenomom-wide.
Ultra-low input CUT&RUN (uliCUT&RUN), en variant av CUT&RUN som muliggjør bruk av lave og encellede innganger, ble beskrevet i 201923. Her beskrives metodikken for en manuell 96-brønnsformat encellet applikasjon. Det er viktig å merke seg at siden utviklingen av uliCUT&RUN har to alternativer for histoneprofilering, CUT&Tag og iACT-seq blitt utviklet, noe som gir robust og svært parallell profilering av histoneproteiner 24,25. Videre har scCUT&Tag blitt optimalisert for profilering av flere faktorer i en enkelt celle (multiCUT&Tag) og for anvendelse på ikke-histone proteiner26. Sammen gir CUT&RUN et attraktivt alternativ til lav inngang ChIP-seq der uliCUT&RUN kan utføres i ethvert molekylærbiologisk laboratorium som har tilgang til en cellesortering og standardutstyr.
Protocol
Representative Results
Discussion
CUT&RUN er en effektiv protokoll for å bestemme proteinlokalisering på kromatin. Den har mange fordeler i forhold til andre protokoller, inkludert: 1) høyt signal-til-støy-forhold, 2) rask protokoll og 3) lav sekvensering lesedekning som kreves og dermed føre til kostnadsbesparelser. Bruken av Protein A- eller Protein A/G-MNase gjør det mulig å påføre CUT&RUN med alle tilgjengelige antistoffer; Derfor har den potensial til raskt og enkelt å profilere mange proteiner. Tilpasning til encellet for proteinprofileri…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker medlemmer av Hainer Lab for lesing og kommentarer til en tidligere versjon av dette manuskriptet. Dette prosjektet brukte NextSeq500 tilgjengelig ved University of Pittsburgh Health Sciences Sequencing Core ved UPMC Children’s Hospital of Pittsburgh for sekvensering med spesiell takk til regissøren William MacDonald. Denne forskningen ble delvis støttet av University of Pittsburgh Center for Research Computing gjennom dataressursene som ble gitt. Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health Grant Number R35GM133732 (til S.J.H.).
Materials
| 1.5 mL clear microfuge tubes | ThermoFisher Scientific | 90410 | |
| 1.5 mL tube magnetic rack | ThermoFisher Scientific | 12321D | |
| 1.5 mL tube-compatible cold centrifuge | Eppendorf | 5404000537 | |
| 10 cm sterile tissue culture plates | ThermoFisher Scientific | 150464 | |
| 10X T4 DNA Ligase buffer | New England Biolabs | B0202S | |
| 15 mL conical tubes | VWR | 89039-656 | |
| 1X TE buffer | ThermoFisher Scientific | 12090015 | |
| 200 µL PCR tubes | Eppendorf | 951010022 | |
| 2X quick ligase buffer | New England Biolabs | M2200 | Ligase Buffer |
| 5X KAPA HiFi buffer | Roche | 7958889001 | 5X high fidelity PCR buffer |
| 7-Amino-Actinomycin D (7-AAD) | Fisher Scientific | BDB559925 | |
| 96-well magnetic rack | ThermoFisher Scientific | 12027 or 12331D | |
| 96-well plate | VWR | 82006-636 | |
| AMPure XP beads | Beckman Coulter | A63881 | polystyrene-magnetite beads; Due to potential variability between AMPure XP bead lots, it is recommended that your AMPure bead solution be calibrated. See manufacturer’s instructions |
| Antibody to protein of interest | varies | ||
| ATP | ThermoFisher Scientific | R0441 | |
| BioMag Plus Concanavalin A beads | Polysciences | 86057-10 | ConA-conjugated paramagnetic microspheres |
| BSA | |||
| Calcium Chloride (CaCl2) | Fisher Scientific | AAJ62905AP | |
| Cell sorter | BD FACSAria II cell sorter | Requires training | |
| Cell-specific media for cell culture | Varies | ||
| Chloroform | ThermoFisher Scientific | C298-500 | Chloroform is a skin irritant and harmful if swallowed; handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles |
| Computer with 64-bit processer and access to a super computing cluster | For computational analyses of resulting sequencing datasets | ||
| DNA spin columns | Epoch Life Sciences | 1920-250 | |
| dNTP set | New England Biolabs | N0446S | |
| EGTA | Sigma Aldrich | E3889 | |
| Electrophoresis equipment | varies | ||
| Ethanol | Fisher Scientific | 22032601 | 100% vol/vol ethanol is highly flammable; handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Fisher Scientific | BP2482100 | |
| FBS | Sigma Aldrich | F2442 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-1 | |
| Glycogen | VWR | 97063-256 | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-500 | |
| Heterologous S. cerevisiae DNA spike-in | homemade | Prepared from crosslinked, MNase-digested, and agarose gel extracted genomic DNA purified of protein/RNA and diluted to 10 ng/mL. We recommend yeast genomic DNA, but other organisms can be used if needed. | |
| Hydrochloric Acid (HCl) | Fisher Scientific | A144-212 | Hydrochloric Acid is very corrosive; handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles |
| Ice Bucket | varies | ||
| Illumina Sequencing platform (e.g., NextSeq500) | Illumina | ||
| Incubator with temperature and atmosphere control | ThermoFisher Scientific | 51030284 | |
| KAPA HotStart HiFi DNA Polymerase with 5X KAPA HiFi buffer | Roche | 7958889001 | hotstart high fidelity polymerase |
| Laminar flow hood | Bakery Company | SG404 | |
| Manganese Chloride (MnCl2) | Sigma Aldrich | 244589 | |
| Micropipette set | Rainin | 30386597 | |
| Minifuge | Benchmark Scientific | C1012 | |
| NEB Adaptor | New England Biolabs | E6612AVIAL | Adaptor |
| NEB Universal primer | New England Biolabs | E6611AVIAL | Universal Primer |
| NEBNext Multiplex Oligos for Illumina kit | New England Biolabs | E7335S/L, E7500S/L, E7710S/L, E7730S/L | Indexed Primers |
| Negative control antibody | Antibodies-Online | ABIN101961 | |
| Nuclease Free water | New England Biolabs | B1500S | |
| PCR thermocycler | Eppendorf | 2231000666 | |
| Phase lock tubes | Qiagen | 129046 | |
| Phenol/Chloroform/Isoamyl Alcohol (PCI) | ThermoFisher Scientific | 15593049 | Phenol is harmful if swallowed or upon skin contact; handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles |
| Phsophate buffered saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | 10814010 | |
| Pipette aid | Drummond Scientific | # 4-000-100 | |
| Polyethylene glycol (PEG) 4000 | VWR | A16151 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Sigma Aldrich | P3911 | |
| Potassium Hydroxide (KOH) | Fisher Scientific | P250-1 | CAUTION KOH is an eye/skin irritant as a solid and corrosive in solution. Handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles |
| Protease Inhibitors | ThermoFisher Scientific | 78430 | |
| ProteinA/G-MNase | Epicypher | 15-1016 | pA/G-MNase |
| ProteinA-MNase, purified from pK19pA-MN | Addgene | 86973 | |
| Proteinase K | New England Biolabs | P8107S | |
| Qubit 1X dsDNA HS Assay Kit | ThermoFisher Scientific | Q33230 | |
| Qubit Assay tubes | ThermoFisher Scientific | Q32856 | |
| Qubit Fluorometer | ThermoFisher Scientific | Q33238 | |
| Quick Ligase with 2X Quick Ligase buffer | New England Biolabs | M2200S | |
| RNase A | New England Biolabs | T3010 | |
| Sodium Acetate (NaOAc) | ThermoFisher Scientific | BP333-500 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma Aldrich | S5150-1L | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | ThermoFisher Scientific | BP166-500 | SDS is poisonous if inhaled; handle with care in well ventilated spaces using gloves, eye protection, and an N95-grade respirator when handling |
| Sodium Hydroxide (NaOH) | Fisher Scientific | S318-1 | NaOH is an eye/skin irritant as a solid and corrosive in solution. Handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles |
| Spermidine | Sigma Aldrich | S2626 | |
| Standard Inverted Light Microscope | Leica | 11526213 | |
| Standard lab agarose gel materials | Varies | ||
| Standard lab materials such as serological pipettes and pipette tips | Varies | ||
| T4 DNA Ligase | New England Biolabs | M0202S | |
| T4 DNA Polymerase | New England Biolabs | M0203S | |
| T4 PNK | New England Biolabs | M0201S | |
| Tabletop vortexer | Fisher Scientific | 2215414 | |
| Taq DNA Polymerase | New England Biolabs | M0273S | |
| Thermomixer | Eppendorf | 5384000020 | Alternatively, can use a waterbath |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152-5 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | 9002-93-1 | Triton X-100 is hazardous; use a lab coat, gloves, and goggles when handling |
| Trypsin | Fisher Scientific | MT25052 | |
| Tube rotator | VWR | 10136084 | |
| USER enzyme | New England Biolabs | M5505S |
Riferimenti
- Gilmour, D. S., Lis, J. T. In vivo interactions of RNA polymerase II with genes of Drosophila melanogaster. Molecular and Cellular Biology. 5 (8), 2009-2018 (1985).
- Solomon, M. J., Varshavsky, A. Formaldehyde-mediated DNA-protein crosslinking: a probe for in vivo chromatin structures. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (19), 6470-6474 (1985).
- Irvine, R. A., Lin, I. G., Hsieh, C. -. L. DNA methylation has a local effect on transcription and histone acetylation. Molecular and Cellular Biology. 22 (19), 6689-6696 (2002).
- Albert, I., et al. Translational and rotational settings of H2A.Z nucleosomes across the Saccharomyces cerevisiae genome. Nature. 446 (7135), 572-576 (2007).
- Blat, Y., Kleckner, N. Cohesins bind to preferential sites along yeast chromosome III, with differential regulation along arms versus the centric region. Cell. 98 (2), 249-259 (1999).
- Ren, B., et al. Genome-wide location and function of DNA binding proteins. Science. 290 (5500), 2306-2309 (2000).
- Rhee, H. S., Pugh, B. F. Comprehensive genome-wide protein-DNA interactions detected at single-nucleotide resolution. Cell. 147 (6), 1408-1419 (2011).
- He, Q., Johnston, J., Zeitlinger, J. ChIP-nexus enables improved detection of in vivo transcription factor binding footprints. Nature Biotechnology. 33 (4), 395-401 (2015).
- O’Neill, L. P., Turner, B. M. Immunoprecipitation of native chromatin: NChIP. Methods. 31 (1), 76-82 (2003).
- Schmidl, C., Rendeiro, A. F., Sheffield, N. C., Bock, C. ChIPmentation: fast, robust, low-input ChIP-seq for histones and transcription factors. Nature Methods. 12 (10), 963-965 (2015).
- Cao, Z., Chen, C., He, B., Tan, K., Lu, C. A microfluidic device for epigenomic profiling using 100 cells. Nature Methods. 12 (10), 959-962 (2015).
- Shankaranarayanan, P., et al. Single-tube linear DNA amplification (LinDA) for robust ChIP-seq. Nature Methods. 8 (7), 565-567 (2011).
- Rotem, A., et al. Single-cell ChIP-seq reveals cell subpopulations defined by chromatin state. Nature Biotechnology. 33 (11), 1165-1172 (2015).
- Grosselin, K., et al. High-throughput single-cell ChIP-seq identifies heterogeneity of chromatin states in breast cancer. Nature Genetics. 51 (6), 1060-1066 (2019).
- Adli, M., Bernstein, B. E. Whole-genome chromatin profiling from limited numbers of cells using nano-ChIP-seq. Nature Protocols. 6 (10), 1656-1668 (2011).
- Zwart, W., et al. A carrier-assisted ChIP-seq method for estrogen receptor-chromatin interactions from breast cancer core needle biopsy samples. BMC Genomics. 14, 232 (2013).
- Valensisi, C., Liao, J. L., Andrus, C., Battle, S. L., Hawkins, R. D. cChIP-seq: a robust small-scale method for investigation of histone modifications. BMC Genomics. 16, 1083 (2015).
- Brind’Amour, J., et al. An ultra-low-input native ChIP-seq protocol for genome-wide profiling of rare cell populations. Nature Communications. 6, 6033 (2015).
- Schmid, M., Durussel, T., Laemmli, U. K. C. h. I. C. ChlC and ChEC; genomic mapping of chromatin proteins. Molecular Cell. 16 (1), 147-157 (2004).
- Zentner, G. E., Kasinathan, S., Xin, B., Rohs, R., Henikoff, S. ChEC-seq kinetics discriminates transcription factor binding sites by DNA sequence and shape in vivo. Nature Communications. 6, 8733 (2015).
- Skene, P. J., Henikoff, S. An efficient targeted nuclease strategy for high-resolution mapping of DNA binding sites. eLife. 6, 21856 (2017).
- Meers, M. P., Bryson, T. D., Henikoff, J. G., Henikoff, S. Improved CUT&RUN chromatin profiling tools. eLife. 8, 46314 (2019).
- Hainer, S. J., Bošković, A., McCannell, K. N., Rando, O. J., Fazzio, T. G. Profiling of pluripotency factors in single cells and early embryos. Cell. 177 (5), 1319-1329 (2019).
- Kaya-Okur, H. S., et al. CUT&Tag for efficient epigenomic profiling of small samples and single cells. Nature Communications. 10 (1), 1930 (2019).
- Carter, B., et al. Mapping histone modifications in low cell number and single cells using antibody-guided chromatin tagmentation (ACT-seq). Nature Communications. 10 (1), 3747 (2019).
- Gopalan, S., Wang, Y., Harper, N. W., Garber, M., Fazzio, T. G. Simultaneous profiling of multiple chromatin proteins in the same cells. Molecular Cell. 81 (22), 4736-4746 (2021).
- Patty, B. J., Hainer, S. J. Transcription factor chromatin profiling genome-wide using uliCUT&RUN in single cells and individual blastocysts. Nature Protocols. 16 (5), 2633-2666 (2021).
- Zheng, X. -. Y., Gehring, M. Low-input chromatin profiling in Arabidopsis endosperm using CUT&RUN. Plant Reproduction. 32 (1), 63-75 (2019).
- Buenrostro, J. D., Giresi, P. G., Zaba, L. C., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position. Nature Methods. 10 (12), 1213-1218 (2013).
- Buenrostro, J. D., et al. Single-cell chromatin accessibility reveals principles of regulatory variation. Nature. 523 (7561), 486-490 (2015).
