Method Article

Ingegneria di agenti antivirali tramite risonanza plasmonica di superficie

DOI:

10.3791/63541

⸱

June 14th, 2022

1Department of Environmental Health Sciences, University of California, Los Angeles, 2Department of General Surgery, Medical University of Vienna

In This Article

Summary

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Il presente protocollo descrive nuovi strumenti per i saggi di legame SPR per esaminare il legame CV-N a HA, glicoproteina S, glicani di tipo ibrido correlati e oligosaccaridi ad alto mannosio. SPR è usato per determinare il KD per legare CV-N dimerico o monomerico a questi glicani.

Abstract

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La risonanza plasmonica di superficie (SPR) viene utilizzata per misurare il legame dell'emoagglutinina (HA) al dimero di cianovirina-N (CV-N) scambiato di dominio e per monitorare le interazioni tra peptidi mannosilati e sito di legame ad alta affinità di CV-N. I picchi dell'involucro virale gp120, HA e glicoproteina di Ebola (GP) 1,2 sono stati segnalati per legare entrambi i siti di legame ad alta e bassa affinità su CVN2 dimerico. Il peptide HA dimannosilato è anche legato nei due siti di legame a bassa affinità a una molecola ingegnerizzata di CVN2, che porta un sito ad alta affinità per il rispettivo ligando e muta per sostituire un legame disolfuro stabilizzante nella tasca di legame dei carboidrati, confermando così il legame multivalente. Il legame con l'HA è mostrato in un sito di legame ad alta affinità dello pseudo-anticorpo CVN2 a una costante di dissociazione (KD) di 275 nM che neutralizza ulteriormente il virus dell'immunodeficienza umana di tipo 1 (HIV-1) attraverso l'oligomerizzazione. Correlando il numero di ponti disolfuro in CVN2 scambiati di dominio, che sono diminuiti da 4 a 2 sostituendo le cistine in coppie di residui polari di acido glutammico e arginina, si ottiene una ridotta affinità di legame con l'HA. Tra le interazioni più forti, Ebola GP1,2 è legato da CVN2 con due siti di legame ad alta affinità nell'intervallo nanomolare inferiore utilizzando il glicano dell'involucro senza un dominio transmembrana. Nel presente studio, il legame della glicoproteina monomerica multispecifica CV-N alla sindrome respiratoria acuta grave coronavirus 2 (SARS-CoV-2) spike (S) è misurato a K D = 18,6 μM rispetto al nanomolare KD a quegli altri picchi virali e attraverso il suo dominio di legame del recettore nell'intervallo medio-μ-molare.

Introduction

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L'attività antivirale associata alla terina è indotta dall'interferone-α e comprende legami a base di proteine, che portano alla ritenzione di virioni completamente formati sulle superfici cellulari infette1. La necessità della glicosilazione della teterina nell'inibizione del rilascio del virus rimane incerta, il che implica l'importanza dei pattern di glicosilazione sui glicani espressi in modo ricombinante per gli studi in vitro 1,2, che dipende dalla conformazione dell'emoagglutinina HA 3,4 dell'influenza espressa in superfici....

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Protocol

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Per il presente studio, una proteina di fusione CVN-small ubiquitina-like modifier (SUMO) è stata utilizzata nei saggi di immunoassorbimento enzimatico invece di CV-N ed è adatta per saggi basati su cellule. La proteina H3 ricombinante a lunghezza intera del virus dell'influenza A HA è ottenuta commercialmente (vedi tabella dei materiali) o espressa in linee cellulari HEK293 di mammiferi e cellule di insetti infettate da baculovirus secondo i protocolli standard12. La proteina spike Wuhan-1 è espressa nelle cellule HEK293 dei mammiferi. La sintesi del peptide monomannosilato (MM) e del peptide dimannosilato (DM) permette la ril....

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Results

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Una molecola CVN2L0 scambiata di dominio dimerico viene testata per il legame alla regione superiore dell'HA in tre esperimenti SPR separati e l'affinità di legame è presentata in valori KD. Si presume che il dominio B comprenda siti di legame H, che sono influenzati dalla sostituzione di un legame disolfuro in residui ionici, e il dominio A forma L10,18. Le singole iniezioni di CVN2L0 e delle varianti V2 (tre ponti disolfuro) e V5 (due ponti disolfuro.......

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Discussion

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L'affinità di legame di CV-N è correlata al numero di siti di legame funzionali [2H sui domini B e 2L sui domini A quando progettati come dimero scambiati di dominio]. Una variante con un'alterata affinità di legame (CVN2L0-V2, una piega omodimerica stabile di CV-N comprendente un knock-out del ponte disolfuro) è espressa in E. coli, purificata e testata positivamente per il legame alla proteina HA (H3N2) usando SPR10, e mostra un cambiamento conformazionale dopo aver legato HA con siti d.......

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Disclosures

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L'autore non ha nulla da rivelare.

Acknowledgements

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L'autore riconosce il Dr. Christian Derntl del Dipartimento di Biotecnologia e Microbiologia presso la TU Wien e il Dipartimento di Medicina III, Divisione di Nefrologia e Dialisi presso l'Università di Medicina di Vienna, in particolare il Dr. Markus Wahrmann per il supporto tecnico e scientifico. L'espressione proteica nelle cellule di mammifero è stata sostenuta dal Dipartimento di Biotecnologie dell'Università di Risorse Naturali e Scienze della Vita (BOKU) di Vienna. L'autrice vuole esprimere il suo profondo riconoscimento al Dr. Nico Dankbar di XanTec bioanalytics a Duesseldorf, in Germania, per utili discussioni scientifiche sull'esecuzione dei saggi di legame ....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Ä kta primeplusCytiva
Amicon tubiMerckC7715
AmpillicinSigma-AldrichA5354
Beckmann Coulter Cooler Allegra X-30R centrifugaBeckman CoulterB06320
SpandiconcimeSigma-AldrichHS86655acciaio inossidabile argento, barra L 33  mm
Custom DNA OligosSigma-AldrichOLIGO
Custom GensynthesisGenScript#1390661 vettore di clonazione: pET27b(+) 
Cytiva  HBS-EP+ Tampone 10, 4x50mLThermo Scientific50-105-5354
Dionex UlitMate 3000Thermo ScientificIQLAAAGABHFAPBBMBFB
Enzima di restrizione Dpn I (10 U/μ L) Fisher ScientificER1701
DTTMerckDTT-RO
EDCMerck39391
EDTAMerckE9884
Eppendorf Safe-Lock TubesEppendorf30120086
Eppendorf Safe-Lock TubesEppendorf30120094
Eppendorf  Minispin  e Microcentrifuga personale MiniSpin PlusSigma-AldrichZ606235
EtanoloMerck51976
Etanolammina HClMerckE6133
Falcon 50mL Provette da centrifuga conicheFisher Scientific14-432-22
Falcon 14 mL Provetta in polistirene a fondo tondo, con tappo a scatto, sterile, 25/confezioneCorning352057
GlucosioMerckG8270
Glicina HClMerck55097
HA H3 proteinaAbcamab69751
HEPESMerckH3375
His-select Ni2+MerckH0537
ImidazoloMerckI2399
IPTGMerckI6758
Kanamicina ASigma-AldrichK1377
Kromasil 300-5-C4Nouryon
LB agarMerck52062
LB agarMerck19344
LB LennoxMerckL3022
LisozimaMerck10837059001
Cloruro di magnesioMerckM8266
Solfato di magnesioMerckM7506
NaH2P04MerckS0751
Spettrofotometro NanoDrop UV-Vis2000cThermo ScientificND2000CLAPTOP
NaOHMerckS5881
NHSMerck130672
NZ ammina ( idrolizzato di caseina)MerckC0626
PBSMerck806552
PD MidiTrap G-10Sigma-AldrichGE28-9180-11
PeptoneMerck70171
pET11aMerck Millipore (Novagen)69436 
PMSFMerckPMSF-RO
QIAprep Spin Miniprep Kit (1000)Qiagen27106X4
Reichert Pacchetto software Autolink1-1-9Reichert Reichert
SPR SR7500DC Sistema a doppio canaleReichert
Scrubber2-2012-09-04 per l'analisi dei datiReichert
SDSKitMerck 11667289001
con plasmide di controllo pUC18Stratagene#200518
cloruro di SodimMerckS9888
acetato di sodio. Chip sensore SPR TriidratoMerck236500
C19RBDHC30MXanTec bioanalyticsSCR C19RBDHC30M
chip sensore SPR CMD500DXanTec bioanalyticsSCR CMD500D
Sterilin Standard 90mm Piastre di PetriThermo Scientific101R20
TBSMerckT591210x, soluzione
Triton-X100MerckT8787
TryptoneMerck93657
Tween20MerckP1379
Vortex-Genie 2 MixerMerckZ258423
X-galMerckXGAL-RO
XL1-Blue Supercompetent CellsStratagene#200236
Estratto di lievitoMerckY1625
per mutagenesi sito-specifica

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Perez-Caballero, D., et al. Tetherin inhibits HIV-1 release by directly tethering virions to cells. Cell. 139 (3), 499-511 (2009).
  2. Waheed, A. A., Gitzen, A., Swiderski, M., Freed, E. O. High-mannose but not complex-type glycosylation of tetherin i....

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Surface Plasmon ResonanceAntiviral Agent EngineeringHemagglutinin BindingCyanovirin N DimerMannosylated PeptidesVirus Envelope GlycoproteinsProtein Ligand InteractionSPR BiosensingHigh Affinity BindingRecombinant Protein Expression

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