Isolering af primære muse retinale pigmenterede epitelceller
Summary
Dette manuskript beskriver en forenklet protokol til isolering af retinale pigmenterede epitel (RPE) celler fra museøjne på en trinvis måde. Protokollen inkluderer enukleation og dissektion af museøjne efterfulgt af isolering, såning og dyrkning af RPE-celler.
Abstract
Det retinale pigmenterede epitel (RPE) lag ligger umiddelbart bag fotoreceptorerne og har et komplekst metabolisk system, der spiller flere kritiske roller i opretholdelsen af fotoreceptorernes funktion. Således er RPE-strukturen og -funktionen afgørende for at opretholde et normalt syn. Dette manuskript præsenterer en etableret protokol for primær RPE-celleisolering af mus. RPE-isolering er et godt værktøj til at undersøge de molekylære mekanismer, der ligger til grund for RPE-patologi i de forskellige musemodeller af okulære lidelser. Desuden kan RPE-isolering hjælpe med at sammenligne primære muse-RPE-celler isoleret fra vildtype og genetisk modificerede mus samt teste lægemidler, der kan fremskynde udviklingen af terapi for synsforstyrrelser. Manuskriptet præsenterer en trin-for-trin RPE-isolationsprotokol; Hele proceduren, fra enukleation til såning, tager cirka 4 timer. Medierne bør ikke ændres i 5-7 dage efter såning for at tillade vækst af de isolerede celler uden forstyrrelse. Denne proces efterfølges af karakterisering af morfologi, pigmentering og specifikke markører i cellerne via immunfluorescens. Celler kan passeres maksimalt tre eller fire gange.
Introduction
Retinale pigmenterede epitelceller (RPE) er placeret mellem choroid og neurale nethinden og danner et simpelt monolag af kuboidale celler, der ligger bag fotoreceptorcellerne (PR)1. RPE spiller en afgørende rolle i opretholdelsen af et sundt miljø for PR-celler, hovedsageligt ved at reducere overdreven ophobning af reaktive iltarter (ROS) og deraf følgende oxidative skader1. RPE-celler overvåger mange funktioner, såsom omdannelse og opbevaring af retinoider, absorption af spredt lys-, væske- og iontransport og fagocytose af skurets PR-ydre segmentmembran 2,3. Ændringer i RPE (morfologi/funktion) kan forringe deres funktion, hvilket fører til retinopati, og dette er et fælles træk, der deles af mange okulære lidelser4. Mange okulære sygdomme er forbundet med ændringer i RPE-cellernes morfologi og funktion, herunder nogle genetiske sygdomme såsom retinitis pigmentosa, Leber medfødt amaurose og albinisme 4,5,6 samt aldersrelaterede okulære lidelser såsom diabetisk retinopati (DR) og aldersrelateret makuladegeneration (AMD)7,8 . Humane celler er de mest ønskelige, og det ville derfor være ideelt at studere RPE-lidelser i primære humane RPE-celler til dannelse af RPE-monolag. Etiske spørgsmål og den begrænsede tilgængelighed af humane donorer på grund af det faktum, at de fleste af disse lidelser fører til sygelighed9, men ikke nødvendigvis dødelighed10, forhindrer derved isolering af primære humane RPE-celler. Dette gør dyrkning af RPE-celler fra ikke-menneskelige dyredonorer til et foretrukket alternativ. Gnavere, især mus, betragtes som en god model til undersøgelse af forskellige okulære sygdomme, da transgen teknologi er mere omfattende etableret i disse arter11. Selvom brugen af dyrkede primære RPE-celler giver mange fordele, har det været svært at vedligeholde voksende celler i mange passager eller at opbevare og genbruge cellerne. Den største begrænsning af denne protokol er musenes alder; mus, der bruges til RPE-isolering, bør være i en meget ung alder (18-21 dage gammel er optimal), da det har været vanskeligt at dyrke RPE-celler fra voksne mus11,12,13. RPE-celler kan isoleres fra museøjne i alle aldre, men op til fire cellepassager var kun vellykkede med unge mus (18-21 dage gamle). RPE-isolering fra musenethinder ved hjælp af både C57BL6-mus og transgene mus med sletning af N-methyl-D-aspartatreceptorerne (NMDAR’er) ved RPE-cellerne blev udført for at studere effekten af forhøjet aminosyrehomocystein på udviklingen og progressionen af AMD14. Derudover hjalp isolerede primære RPE-celler med at foreslå et terapeutisk mål for AMD ved hæmning af NMDAR’erne ved RPE-celler14. Der er nogle NMDAR-blokkere, der er godkendt af Food and Drug Administration (FDA) og bruges i øjeblikket til behandling af moderat til svær forvirring (demens) relateret til Alzheimers sygdom (AD), såsom memantin16, som kan være et potentielt terapeutisk mål for AMD14. Desuden blev isolerede primære muse-RPE-celler anvendt til påvisning af inflammatoriske markører og den foreslåede induktion af inflammation som en underliggende mekanisme for homocysteininducerede træk ved AMD og AD ved anvendelse af en genetisk modificeret mus (CBS), som præsenterer et højt niveau af homocystein16,17.
Denne protokol blev brugt til at isolere RPE-celler fra både vildtype C57BL/6-mus og transgene mus udviklet i vores laboratorium som en forenklet tilpasning af andre offentliggjorte isolationsprotokoller13,18,19 for at nå en let anvendelig og pålidelig protokol. Der er ingen sexpræference i denne protokol. Mens mus aldre er kritiske for isolationsprocessen, blev unge, gamle mus (18-21 dage gamle) og ældre mus i alle aldre (op til 12 måneder) brugt til RPE-isolering. Vi bemærkede imidlertid, at RPE-cellerne isoleret fra de unge ældre mus levede længere, og op til fire passager kunne udføres. RPE-cellerne isoleret fra ældre mus kunne passeres en eller to gange, så ville de stoppe med at vokse med en normal hastighed og ændre deres form til at være mere langstrakt (fibroblastlignende celler). Tab af pigmentering og nedsat vedhæftning til vævskulturpladen efterfulgt af løsrivelse blev også observeret.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den nuværende protokol er en rapporteret, ændret og forenklet detaljeret procedure for RPE-isolering fra museøjne. Protokollen inkluderer enukleation, dissektion, indsamling, såning, kultur og karakterisering af RPE-celler isoleret fra museøjne.
Der er nogle begrænsninger og kritiske trin, der skal opfyldes for en vellykket RPE-isolering, såsom musens alder, antallet af dissekerede øjne, størrelsen på vævskulturpladen eller skålen og advarsler efter såning, opbevaring og passaging…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af National Eye Institute (NEI), National Eye Institute (NEI) fond R01 EY029751-04
Materials
| Beaker : 100mL | KIMAX | 14000 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma-Aldrich | C7657-25MG | For working enzyme, A |
| Disposable Graduated Transfer Pipettes :3.2mL Sterile | 13-711-20 | ||
| DMEM/F12 | gibco | 11330 | Media to grow RPE cells |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | gibco | 26140079 | For complete RPE cell culture media |
| Gentamicin Reagent Solution | gibco | 15750-060 | For complete RPE cell culture media |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) | Thermo Scientific | 88284 | For working enzymes (A&B) |
| Heracell VISO 160i CO2 Incubator | Thermo Scientific | 50144906 | |
| Hyaluronidase from bovine testes | Sigma-Aldrich | H3506-500MG | For working enzyme A |
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 34155 | |
| Luer-Lok Syringe with attached needle 21 G x 1 1/2 in., sterile, single use, 3 mL | B-D | 309577 | |
| Micro Centrifuge Tube: 2 mL | Grainger | 11L819 | |
| Mouse monoclonal anti-RPE65 antibody | Abcam, Cambridge, MA, USA | ab78036 | For IF staining |
| Pen Strep | gibco | 15140-122 | For complete RPE cell culture media |
| Positive Action Tweezers, Style 5/45 | Dumont | 72703-DZ | |
| Scissors Iris Standard Straight 11.5cm | GARANA INDUSTRIES | 2595 | |
| Sorvall St8 Centrifuge | ThermoScientific | 75007200 | |
| Stemi 305 Microscope | Zeiss | n/a | |
| Surgical Blade, #11, Stainless Steel | Bard-Parker | 371211 | |
| Suspension Culture Dish 60mm x 15mm Style | Corning | 430589 | |
| Tissue Culture Dish : 100x20mm style | Corning | 353003 | |
| Tornado Tubes: 15mL | Midsci | C15B | |
| Tornado Tubes: 50mL | Midsci | C50R | |
| Trypsin EDTA (1x) 0.25% | gibco | 2186962 | For working enzyme B |
| Tweezers 5MS, 8.2cm, Straight, 0.09×0.05mm Tips | Dumont | 501764 | |
| Tweezers Positive Action Style 5, Biological, Dumostar, Polished Finish, 110 mm OAL | Electron Microscopy Sciences Dumont | 50-241-57 | |
| Underpads, Moderate : 23" X 36" | McKesson | 4033 | |
| Vannas Spring Scissors – 2.5mm Cutting Edge | FST | 15000-08 | |
| Zeiss AxioImager Z2 | Zeiss | n/a | |
| Zeiss Zen Blue 2.6 | Zeiss | n/a |
Riferimenti
- Young, R. W., Droz, B. The renewal of protein in retinal rods and cones. The Journal of Cell Biology. 39 (1), 169-184 (1968).
- Sparrow, J. R., Hicks, D., Hamel, C. P. The retinal pigment epithelium in health and disease. Current Molecular Medicine. 10 (9), 802-823 (2010).
- Strauss, O. The retinal pigment epithelium in visual function. Physiological Reviews. 85 (3), 845-881 (2005).
- Marlhens, F., et al. Autosomal recessive retinal dystrophy associated with two novel mutations in the RPE65 gene. European Journal of Human Genetics. 6 (5), 527-531 (1998).
- Morimura, H., et al. Mutations in the RPE65 gene in patients with autosomal recessive retinitis pigmentosa or leber congenital amaurosis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 95 (6), 3088-3093 (1998).
- Weiter, J. J., Delori, F. C., Wing, G. L., Fitch, K. A. Retinal pigment epithelial lipofuscin and melanin and choroidal melanin in human eyes. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 27 (2), 145-152 (1986).
- Feeney-Burns, L., Hilderbrand, E. S., Eldridge, S. Aging human RPE: morphometric analysis of macular, equatorial, and peripheral cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 25 (2), 195-200 (1984).
- Ibrahim, A. S., et al. Hyperhomocysteinemia disrupts retinal pigment epithelial structure and function with features of age-related macular degeneration. Oncotarget. 7 (8), 8532-8545 (2016).
- Zarbin, M. A. Age-related macular degeneration: review of pathogenesis. European Journal of Ophthalmology. 8 (4), 199-206 (1998).
- Dunn, K. C., Aotaki-Keen, A. E., Putkey, F. R., Hjelmeland, L. M. ARPE-19, a human retinal pigment epithelial cell line with differentiated properties. Experimental Eye Research. 62 (2), 155-170 (1996).
- Flannery, J. G. Transgenic animal models for the study of inherited retinal dystrophies. ILAR Journal. 40 (2), 51-58 (1999).
- Gibbs, D., Williams, D. S. Isolation and culture of primary mouse retinal pigmented epithelial cells. Advances in Experimental Medicine and Biology. 533, 347-352 (2003).
- Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. Isolation, culture, and characterization of primary mouse RPE cells. Nature Protocols. 11 (7), 1206-1218 (2016).
- Samra, Y. A., et al. Implication of N-Methyl-d-Aspartate receptor in homocysteine-induced age-related macular degeneration. International Journal of Molecular Sciences. 22 (17), 9356 (2021).
- van Marum, R. J. Update on the use of memantine in Alzheimer’s disease. Neuropsychiatric Disease and Treatment. 5, 237-247 (2009).
- Elsherbiny, N. M., et al. Homocysteine induces inflammation in retina and brain. Biomolecules. 10 (3), 393 (2020).
- Tawfik, A., Elsherbiny, N. M., Zaidi, Y., Rajpurohit, P. Homocysteine and age-related central nervous system diseases: role of inflammation. International Journal of Molecular Sciences. 22 (12), 6259 (2021).
- Shang, P., Stepicheva, N. A., Hose, S., Zigler Jr, J. S., Sinha, D. Primary cell cultures from the mouse retinal pigment epithelium. Journal of Visualized Experiments. (133), e56997 (2018).
- Chen, M., et al. Characterization of a spontaneous mouse retinal pigment epithelial cell line B6-RPE07. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 49 (8), 3699-3706 (2008).
- AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2020 Edition. Available from: https://www.avma.org/KB/Policies/Documents/euthanasia.pdf (2020)
- Cai, X., Conley, S. M., Naash, M. I. RPE65: role in the visual cycle, human retinal disease, and gene therapy. Ophthalmic Genetics. 30 (2), 57-62 (2009).
- Pérez-Álvarez, M. J., et al. Vimentin isoform expression in the human retina characterized with the monoclonal antibody 3CB2. Journal of Neuroscience Research. 86 (8), 1871-1883 (2008).
- Tawfik, A., Samra, Y. A., Elsherbiny, N. M., Al-Shabrawey, M. Implication of hyperhomocysteinemia in blood retinal barrier (BRB) dysfunction. Biomolecules. 10 (8), 1119 (2020).
- Promsote, W., Makala, L., Li, B., Smith, S. B., Singh, N., Ganapathy, V., Pace, B. S., Martin, P. Monomethylfumarate induces γ-globin expression and fetal hemoglobin production in cultured human retinal pigment epithelial (RPE) and erythroid cells, and in intact retina. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (8), 5382-5393 (2014).
