Isolatie van primaire retinale gepigmenteerde epitheelcellen van muizen
Summary
Dit manuscript beschrijft een vereenvoudigd protocol voor de isolatie van retinale gepigmenteerde epitheelcellen (RPE) uit muizenogen op een stapsgewijze manier. Het protocol omvat de enucleatie en dissectie van muizenogen, gevolgd door de isolatie, zaaiing en kweek van RPE-cellen.
Abstract
De retinale gepigmenteerde epitheellaag (RPE) ligt direct achter de fotoreceptoren en herbergt een complex metabolisch systeem dat verschillende cruciale rollen speelt bij het handhaven van de functie van de fotoreceptoren. De RPE-structuur en -functie zijn dus essentieel om een normaal gezichtsvermogen te behouden. Dit manuscript presenteert een vastgesteld protocol voor primaire muis RPE-celisolatie. RPE-isolatie is een geweldig hulpmiddel om de moleculaire mechanismen te onderzoeken die ten grondslag liggen aan RPE-pathologie in de verschillende muismodellen van oogaandoeningen. Bovendien kan RPE-isolatie helpen bij het vergelijken van primaire RPE-cellen van muizen die zijn geïsoleerd uit wildtype en genetisch gemodificeerde muizen, evenals het testen van geneesmiddelen die de ontwikkeling van therapie voor visuele stoornissen kunnen versnellen. Het manuscript presenteert een stap-voor-stap RPE-isolatieprotocol; de hele procedure, van enucleatie tot zaaien, duurt ongeveer 4 uur. De media mogen niet worden veranderd gedurende 5-7 dagen na het zaaien, om de groei van de geïsoleerde cellen zonder verstoring mogelijk te maken. Dit proces wordt gevolgd door de karakterisering van morfologie, pigmentatie en specifieke markers in de cellen via immunofluorescentie. Cellen kunnen maximaal drie of vier keer worden gepasseerd.
Introduction
Retinaal gepigmenteerde epitheelcellen (RPE) bevinden zich tussen het vaatvlies en het neurale netvlies en vormen een eenvoudige monolaag van kubusvormige cellen die achter de fotoreceptorcellen (PR) ligt1. De RPE speelt een cruciale rol bij het handhaven van een gezonde omgeving voor PR-cellen, voornamelijk door het verminderen van de overmatige accumulatie van reactieve zuurstofsoorten (ROS) en de daaruit voortvloeiende oxidatieve schade1. RPE-cellen houden toezicht op vele functies, zoals de conversie en opslag van retinoïden, de absorptie van verstrooid licht, vloeistof- en ionentransport en fagocytose van het pr-buitenmembraan 2,3. Veranderingen in de RPE (morfologie/functie) kunnen hun functie aantasten, wat leidt tot retinopathie en dit is een gemeenschappelijk kenmerk dat door veel oogaandoeningen wordt gedeeld4. Veel oogziekten worden geassocieerd met veranderingen in de morfologie en functie van RPE-cellen, waaronder sommige genetische ziekten zoals retinitis pigmentosa, Leber congenitale amaurosis en albinisme 4,5,6, evenals leeftijdsgebonden oculaire aandoeningen zoals diabetische retinopathie (DR) en leeftijdsgebonden maculaire degeneratie (AMD)7,8 . Menselijke cellen zijn het meest wenselijk, dus het zou ideaal zijn om RPE-stoornissen in primaire menselijke RPE-cellen te bestuderen voor het vormen van RPE-monolagen. Ethische kwesties en de beperkte beschikbaarheid van menselijke donoren vanwege het feit dat de meeste van deze aandoeningen leiden tot morbiditeit9, maar niet noodzakelijkerwijsmortaliteit 10, waardoor de isolatie van primaire menselijke RPE-cellen wordt voorkomen. Dit maakt het kweken van RPE-cellen van niet-menselijke dierlijke donoren een voorkeursalternatief. Knaagdieren, met name muizen, worden beschouwd als een geweldig model voor het bestuderen van verschillende oogziekten, omdat transgene technologie uitgebreider is ingeburgerd in deze soorten11. Hoewel het gebruik van gekweekte primaire RPE-cellen veel voordelen biedt, is het moeilijk geweest om groeiende cellen gedurende vele passages te behouden of om de cellen op te slaan en te hergebruiken. De belangrijkste beperking van dit protocol is de leeftijd van de muizen; muizen die worden gebruikt voor RPE-isolatie moeten van een zeer jonge leeftijd zijn (18-21 dagen oud is optimaal) omdat het moeilijk is geweest om RPE-cellen van volwassen muizen 11,12,13 te kweken. RPE-cellen kunnen op elke leeftijd uit muizenogen worden geïsoleerd, maar tot vier celpassages waren alleen succesvol bij jonge muizen (18-21 dagen oud). RPE-isolatie van het netvlies van muizen, met behulp van zowel C57BL6-muizen als transgene muizen met deletie van de N-methyl-D-aspartaatreceptoren (NMDARs) in de RPE-cellen, werd uitgevoerd om het effect van verhoogd aminozuur homocysteïne op de ontwikkeling en progressie van AMD14 te bestuderen. Bovendien hielpen geïsoleerde primaire RPE-cellen bij het voorstellen van een therapeutisch doelwit voor AMD door remming van de NMDARs bij RPE-cellen14. Er zijn enkele NMDAR-blokkers die zijn goedgekeurd door de Food and Drug Administration (FDA) en momenteel worden gebruikt voor de behandeling van matige tot ernstige verwarring (dementie) gerelateerd aan de ziekte van Alzheimer (AD), zoals memantine16, die een potentieel therapeutisch doelwit voor AMD14 zou kunnen zijn. Bovendien werden geïsoleerde primaire muis RPE-cellen gebruikt voor de detectie van ontstekingsmarkers en de voorgestelde inductie van ontsteking als een onderliggend mechanisme voor homocysteïne-geïnduceerde kenmerken van AMD en AD met behulp van een genetisch gemodificeerde muis (CBS), die een hoog niveau van homocysteïne16,17 presenteert.
Dit protocol werd gebruikt om RPE-cellen te isoleren van zowel wild-type C57BL/6-muizen als transgene muizen die in ons laboratorium zijn ontwikkeld als een vereenvoudigde aanpassing van andere gepubliceerde isolatieprotocollen 13,18,19 om een gemakkelijk toepasbaar en betrouwbaar protocol te bereiken. Er is geen geslachtsvoorkeur in dit protocol. Hoewel muizenleeftijden van cruciaal belang zijn voor het isolatieproces, werden jonge, oudere muizen (18-21 dagen oud) en oudere muizen op elke leeftijd (tot 12 maanden) gebruikt voor RPE-isolatie. We merkten echter dat de RPE-cellen geïsoleerd uit de jonge muizen langer leefden en dat er maximaal vier passages konden worden uitgevoerd. De RPE-cellen geïsoleerd van oudere muizen kunnen een of twee keer worden gepasseerd, dan zouden ze stoppen met groeien met een normale snelheid en hun vorm veranderen om meer langwerpig te zijn (fibroblastachtige cellen). Verlies van pigmentatie en verminderde hechting aan de weefselkweekplaat gevolgd door loslating werd ook waargenomen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het huidige protocol is een gerapporteerde, gewijzigde en vereenvoudigde gedetailleerde procedure voor RPE-isolatie van muizenogen. Het protocol omvat enucleatie, dissectie, verzameling, zaaien, cultuur en karakterisering van RPE-cellen geïsoleerd uit muizenogen.
Er zijn enkele beperkingen en kritieke stappen waaraan moet worden voldaan voor succesvolle RPE-isolatie, zoals de leeftijd van muizen, het aantal ontlede ogen, de grootte van de weefselkweekplaat of -schaal en waarschuwingen na het …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door het National Eye Institute (NEI), National Eye Institute (NEI) fonds R01 EY029751-04
Materials
| Beaker : 100mL | KIMAX | 14000 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma-Aldrich | C7657-25MG | For working enzyme, A |
| Disposable Graduated Transfer Pipettes :3.2mL Sterile | 13-711-20 | ||
| DMEM/F12 | gibco | 11330 | Media to grow RPE cells |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | gibco | 26140079 | For complete RPE cell culture media |
| Gentamicin Reagent Solution | gibco | 15750-060 | For complete RPE cell culture media |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) | Thermo Scientific | 88284 | For working enzymes (A&B) |
| Heracell VISO 160i CO2 Incubator | Thermo Scientific | 50144906 | |
| Hyaluronidase from bovine testes | Sigma-Aldrich | H3506-500MG | For working enzyme A |
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 34155 | |
| Luer-Lok Syringe with attached needle 21 G x 1 1/2 in., sterile, single use, 3 mL | B-D | 309577 | |
| Micro Centrifuge Tube: 2 mL | Grainger | 11L819 | |
| Mouse monoclonal anti-RPE65 antibody | Abcam, Cambridge, MA, USA | ab78036 | For IF staining |
| Pen Strep | gibco | 15140-122 | For complete RPE cell culture media |
| Positive Action Tweezers, Style 5/45 | Dumont | 72703-DZ | |
| Scissors Iris Standard Straight 11.5cm | GARANA INDUSTRIES | 2595 | |
| Sorvall St8 Centrifuge | ThermoScientific | 75007200 | |
| Stemi 305 Microscope | Zeiss | n/a | |
| Surgical Blade, #11, Stainless Steel | Bard-Parker | 371211 | |
| Suspension Culture Dish 60mm x 15mm Style | Corning | 430589 | |
| Tissue Culture Dish : 100x20mm style | Corning | 353003 | |
| Tornado Tubes: 15mL | Midsci | C15B | |
| Tornado Tubes: 50mL | Midsci | C50R | |
| Trypsin EDTA (1x) 0.25% | gibco | 2186962 | For working enzyme B |
| Tweezers 5MS, 8.2cm, Straight, 0.09×0.05mm Tips | Dumont | 501764 | |
| Tweezers Positive Action Style 5, Biological, Dumostar, Polished Finish, 110 mm OAL | Electron Microscopy Sciences Dumont | 50-241-57 | |
| Underpads, Moderate : 23" X 36" | McKesson | 4033 | |
| Vannas Spring Scissors – 2.5mm Cutting Edge | FST | 15000-08 | |
| Zeiss AxioImager Z2 | Zeiss | n/a | |
| Zeiss Zen Blue 2.6 | Zeiss | n/a |
Riferimenti
- Young, R. W., Droz, B. The renewal of protein in retinal rods and cones. The Journal of Cell Biology. 39 (1), 169-184 (1968).
- Sparrow, J. R., Hicks, D., Hamel, C. P. The retinal pigment epithelium in health and disease. Current Molecular Medicine. 10 (9), 802-823 (2010).
- Strauss, O. The retinal pigment epithelium in visual function. Physiological Reviews. 85 (3), 845-881 (2005).
- Marlhens, F., et al. Autosomal recessive retinal dystrophy associated with two novel mutations in the RPE65 gene. European Journal of Human Genetics. 6 (5), 527-531 (1998).
- Morimura, H., et al. Mutations in the RPE65 gene in patients with autosomal recessive retinitis pigmentosa or leber congenital amaurosis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 95 (6), 3088-3093 (1998).
- Weiter, J. J., Delori, F. C., Wing, G. L., Fitch, K. A. Retinal pigment epithelial lipofuscin and melanin and choroidal melanin in human eyes. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 27 (2), 145-152 (1986).
- Feeney-Burns, L., Hilderbrand, E. S., Eldridge, S. Aging human RPE: morphometric analysis of macular, equatorial, and peripheral cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 25 (2), 195-200 (1984).
- Ibrahim, A. S., et al. Hyperhomocysteinemia disrupts retinal pigment epithelial structure and function with features of age-related macular degeneration. Oncotarget. 7 (8), 8532-8545 (2016).
- Zarbin, M. A. Age-related macular degeneration: review of pathogenesis. European Journal of Ophthalmology. 8 (4), 199-206 (1998).
- Dunn, K. C., Aotaki-Keen, A. E., Putkey, F. R., Hjelmeland, L. M. ARPE-19, a human retinal pigment epithelial cell line with differentiated properties. Experimental Eye Research. 62 (2), 155-170 (1996).
- Flannery, J. G. Transgenic animal models for the study of inherited retinal dystrophies. ILAR Journal. 40 (2), 51-58 (1999).
- Gibbs, D., Williams, D. S. Isolation and culture of primary mouse retinal pigmented epithelial cells. Advances in Experimental Medicine and Biology. 533, 347-352 (2003).
- Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. Isolation, culture, and characterization of primary mouse RPE cells. Nature Protocols. 11 (7), 1206-1218 (2016).
- Samra, Y. A., et al. Implication of N-Methyl-d-Aspartate receptor in homocysteine-induced age-related macular degeneration. International Journal of Molecular Sciences. 22 (17), 9356 (2021).
- van Marum, R. J. Update on the use of memantine in Alzheimer’s disease. Neuropsychiatric Disease and Treatment. 5, 237-247 (2009).
- Elsherbiny, N. M., et al. Homocysteine induces inflammation in retina and brain. Biomolecules. 10 (3), 393 (2020).
- Tawfik, A., Elsherbiny, N. M., Zaidi, Y., Rajpurohit, P. Homocysteine and age-related central nervous system diseases: role of inflammation. International Journal of Molecular Sciences. 22 (12), 6259 (2021).
- Shang, P., Stepicheva, N. A., Hose, S., Zigler Jr, J. S., Sinha, D. Primary cell cultures from the mouse retinal pigment epithelium. Journal of Visualized Experiments. (133), e56997 (2018).
- Chen, M., et al. Characterization of a spontaneous mouse retinal pigment epithelial cell line B6-RPE07. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 49 (8), 3699-3706 (2008).
- AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2020 Edition. Available from: https://www.avma.org/KB/Policies/Documents/euthanasia.pdf (2020)
- Cai, X., Conley, S. M., Naash, M. I. RPE65: role in the visual cycle, human retinal disease, and gene therapy. Ophthalmic Genetics. 30 (2), 57-62 (2009).
- Pérez-Álvarez, M. J., et al. Vimentin isoform expression in the human retina characterized with the monoclonal antibody 3CB2. Journal of Neuroscience Research. 86 (8), 1871-1883 (2008).
- Tawfik, A., Samra, Y. A., Elsherbiny, N. M., Al-Shabrawey, M. Implication of hyperhomocysteinemia in blood retinal barrier (BRB) dysfunction. Biomolecules. 10 (8), 1119 (2020).
- Promsote, W., Makala, L., Li, B., Smith, S. B., Singh, N., Ganapathy, V., Pace, B. S., Martin, P. Monomethylfumarate induces γ-globin expression and fetal hemoglobin production in cultured human retinal pigment epithelial (RPE) and erythroid cells, and in intact retina. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (8), 5382-5393 (2014).
