Ce manuscrit décrit un protocole simplifié pour l’isolement progressif des cellules de l’épithélium pigmenté rétinien (EPR) des yeux de souris. Le protocole comprend l’énucléation et la dissection des yeux de souris, suivies de l’isolement, de l’ensemencement et de la culture des cellules EPR.
La couche d’épithélium pigmenté rétinien (EPR) se trouve immédiatement derrière les photorécepteurs et abrite un système métabolique complexe qui joue plusieurs rôles critiques dans le maintien de la fonction des photorécepteurs. Ainsi, la structure et la fonction de l’EPR sont essentielles pour maintenir une vision normale. Ce manuscrit présente un protocole établi pour l’isolement primaire des cellules EPR de souris. L’isolement de l’EPR est un excellent outil pour étudier les mécanismes moléculaires sous-jacents à la pathologie de l’EPR dans les différents modèles murins de troubles oculaires. En outre, l’isolement de l’EPR peut aider à comparer les cellules RPE primaires de souris isolées de souris de type sauvage et génétiquement modifiées, ainsi qu’à tester des médicaments qui peuvent accélérer le développement de thérapies pour les troubles visuels. Le manuscrit présente un protocole d’isolement RPE étape par étape; L’ensemble de la procédure, de l’énucléation à l’ensemencement, prend environ 4 heures. Le milieu ne doit pas être changé pendant 5 à 7 jours après l’ensemencement, pour permettre la croissance des cellules isolées sans perturbation. Ce processus est suivi par la caractérisation de la morphologie, de la pigmentation et des marqueurs spécifiques dans les cellules via l’immunofluorescence. Les cellules peuvent être traversées un maximum de trois ou quatre fois.
Les cellules de l’épithélium pigmenté rétinien (EPR) sont situées entre la choroïde et la rétine neurale, formant une simple monocouche de cellules cuboïdes qui se trouve derrière les cellules photoréceptrices (PR)1. L’EPR joue un rôle essentiel dans le maintien d’un environnement sain pour les cellules PR, principalement en réduisant l’accumulation excessive d’espèces réactives de l’oxygène (ROS) et les dommages oxydatifs qui en découlent1. Les cellules EPR supervisent de nombreuses fonctions, telles que la conversion et le stockage des rétinoïdes, l’absorption de la lumière diffusée, le transport des fluides et des ions et la phagocytose dela membrane du segment externe 2,3 du PR. Les altérations de l’EPR (morphologie/fonction) peuvent altérer leur fonction conduisant à la rétinopathie et c’est une caractéristique commune à de nombreux troubles oculaires4. De nombreuses maladies oculaires sont associées à des altérations de la morphologie et de la fonction des cellules EPR, y compris certaines maladies génétiques comme la rétinite pigmentaire, l’amaurose congénitale de Leber et l’albinisme 4,5,6, ainsi que des troubles oculaires liés à l’âge comme la rétinopathie diabétique (RD) et la dégénérescence maculaire liée à l’âge (DMLA)7,8 . Les cellules humaines sont les plus souhaitables, il serait donc idéal d’étudier les troubles de l’EPR dans les cellules RPE humaines primaires pour former des monocouches d’EPR. Cependant, les questions éthiques et la disponibilité limitée des donneurs humains en raison du fait que la plupart de ces troubles entraînent une morbidité9, mais pas nécessairement la mortalité10, empêchant ainsi l’isolement des cellules humaines primaires de l’EPR. Cela fait de la culture de cellules EPR provenant de donneurs animaux non humains une alternative privilégiée. Les rongeurs, en particulier les souris, sont considérés comme un excellent modèle pour l’étude de différentes maladies oculaires puisque la technologie transgénique est plus largement établie chez ces espèces11. Même si l’utilisation de cellules EPR primaires en culture offre de nombreux avantages, il a été difficile de maintenir des cellules en croissance pendant de nombreux passages, ou de stocker et de réutiliser les cellules. La principale limitation de ce protocole est l’âge des souris; les souris utilisées pour l’isolement de l’EPR doivent être très jeunes (18-21 jours est optimal) car il a été difficile de cultiver des cellules EPR à partir de souris adultes11,12,13. Les cellules EPR peuvent être isolées des yeux de souris à tout âge, mais jusqu’à quatre passages cellulaires n’ont été efficaces qu’avec de jeunes souris (âgées de 18 à 21 jours). L’isolement de l’EPR à partir de la rétine de souris, en utilisant à la fois des souris C57BL6 et des souris transgéniques avec délétion des récepteurs N-méthyl-D-aspartate (NMDAR) au niveau des cellules EPR, a été réalisé pour étudier l’effet de l’homocystéine d’acides aminés élevés sur le développement et la progression de la DMLA14. De plus, des cellules RPE primaires isolées ont aidé à proposer une cible thérapeutique pour la DMLA par inhibition des NMDARs sur les cellules RPE14. Certains bloqueurs NMDAR sont approuvés par la Food and Drug Administration (FDA) et sont actuellement utilisés pour traiter la confusion modérée à grave (démence) liée à la maladie d’Alzheimer (MA), comme la mémantine16, qui pourrait être une cible thérapeutique potentielle pour la DMLA14. De plus, des cellules RPE primaires isolées de souris ont été utilisées pour la détection de marqueurs inflammatoires et l’induction proposée de l’inflammation comme mécanisme sous-jacent des caractéristiques induites par l’homocystéine de la DMLA et de la MA à l’aide d’une souris génétiquement modifiée (CBS), qui présente un niveau élevé d’homocystéine16,17.
Ce protocole a été utilisé pour isoler des cellules EPR de souris C57BL/6 de type sauvage et de souris transgéniques développées dans notre laboratoire comme une adaptation simplifiée d’autres protocoles d’isolement publiés13,18,19 pour atteindre un protocole facilement applicable et fiable. Il n’y a pas de préférence sexuelle dans ce protocole. Bien que l’âge des souris soit essentiel pour le processus d’isolement, des souris jeunes et âgées (âgées de 18 à 21 jours) et des souris plus âgées de tout âge (jusqu’à 12 mois) ont été utilisées pour l’isolement de l’EPR. Cependant, nous avons remarqué que les cellules EPR isolées des souris jeunes vivaient plus longtemps et que jusqu’à quatre passages pouvaient être effectués. Les cellules EPR isolées de souris plus âgées pourraient être transmises une ou deux fois, puis elles cesseraient de croître à un rythme normal et changeraient de forme pour être plus allongées (cellules ressemblant à des fibroblastes). Une perte de pigmentation et une diminution de l’adhérence à la plaque de culture tissulaire suivies d’un décollement ont également été observées.
Le protocole actuel est une procédure détaillée rapportée, modifiée et simplifiée pour l’isolement de l’EPR à partir des yeux de souris. Le protocole comprend l’énucléation, la dissection, la collecte, l’ensemencement, la culture et la caractérisation des cellules EPR isolées dans les yeux de souris.
Certaines limites et étapes critiques doivent être respectées pour une isolation réussie de l’EPR, telles que l’âge des souris, le nombre d’yeux disséqués, la taill…
The authors have nothing to disclose.
Ce travail a été soutenu par le National Eye Institute (NEI), National Eye Institute (NEI) fund R01 EY029751-04
Beaker : 100mL | KIMAX | 14000 | |
Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma-Aldrich | C7657-25MG | For working enzyme, A |
Disposable Graduated Transfer Pipettes :3.2mL Sterile | 13-711-20 | ||
DMEM/F12 | gibco | 11330 | Media to grow RPE cells |
Fetal Bovine Serum (FBS) | gibco | 26140079 | For complete RPE cell culture media |
Gentamicin Reagent Solution | gibco | 15750-060 | For complete RPE cell culture media |
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) | Thermo Scientific | 88284 | For working enzymes (A&B) |
Heracell VISO 160i CO2 Incubator | Thermo Scientific | 50144906 | |
Hyaluronidase from bovine testes | Sigma-Aldrich | H3506-500MG | For working enzyme A |
Kimwipes | Kimberly-Clark | 34155 | |
Luer-Lok Syringe with attached needle 21 G x 1 1/2 in., sterile, single use, 3 mL | B-D | 309577 | |
Micro Centrifuge Tube: 2 mL | Grainger | 11L819 | |
Mouse monoclonal anti-RPE65 antibody | Abcam, Cambridge, MA, USA | ab78036 | For IF staining |
Pen Strep | gibco | 15140-122 | For complete RPE cell culture media |
Positive Action Tweezers, Style 5/45 | Dumont | 72703-DZ | |
Scissors Iris Standard Straight 11.5cm | GARANA INDUSTRIES | 2595 | |
Sorvall St8 Centrifuge | ThermoScientific | 75007200 | |
Stemi 305 Microscope | Zeiss | n/a | |
Surgical Blade, #11, Stainless Steel | Bard-Parker | 371211 | |
Suspension Culture Dish 60mm x 15mm Style | Corning | 430589 | |
Tissue Culture Dish : 100x20mm style | Corning | 353003 | |
Tornado Tubes: 15mL | Midsci | C15B | |
Tornado Tubes: 50mL | Midsci | C50R | |
Trypsin EDTA (1x) 0.25% | gibco | 2186962 | For working enzyme B |
Tweezers 5MS, 8.2cm, Straight, 0.09×0.05mm Tips | Dumont | 501764 | |
Tweezers Positive Action Style 5, Biological, Dumostar, Polished Finish, 110 mm OAL | Electron Microscopy Sciences Dumont | 50-241-57 | |
Underpads, Moderate : 23" X 36" | McKesson | 4033 | |
Vannas Spring Scissors – 2.5mm Cutting Edge | FST | 15000-08 | |
Zeiss AxioImager Z2 | Zeiss | n/a | |
Zeiss Zen Blue 2.6 | Zeiss | n/a |