일차 마우스 망막 색소 상피 세포의 분리
Summary
이 원고는 쥐의 눈에서 망막 색소 상피 (RPE) 세포를 단계적으로 분리하기위한 단순화 된 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜에는 마우스 눈의 핵 제거 및 해부, RPE 세포의 분리, 파종 및 배양이 포함됩니다.
Abstract
망막 색소 상피 (RPE) 층은 광 수용체 바로 뒤에 있으며 광 수용체의 기능을 유지하는 데 몇 가지 중요한 역할을하는 복잡한 대사 시스템을 보유하고 있습니다. 따라서 RPE 구조와 기능은 정상적인 시력을 유지하는 데 필수적입니다. 이 원고는 1차 마우스 RPE 세포 분리를 위한 확립된 프로토콜을 제시합니다. RPE 분리는 안구 질환의 다양한 마우스 모델에서 RPE 병리의 기초가 되는 분자 메커니즘을 조사하는 훌륭한 도구입니다. 또한 RPE 분리는 야생형 및 유전자 변형 마우스에서 분리된 1차 마우스 RPE 세포를 비교하고 시각 장애 치료제 개발을 가속화할 수 있는 약물을 테스트하는 데 도움이 될 수 있습니다. 원고는 단계별 RPE 격리 프로토콜을 제시합니다. 핵 제거에서 파종까지 전체 절차는 약 4 시간이 걸립니다. 분리 된 세포의 성장을 방해받지 않고 허용 할 수 있도록 파종 후 5-7 일 동안 배지를 변경해서는 안됩니다. 이 과정은 면역형광을 통해 세포의 형태학, 색소 침착 및 특정 마커의 특성화로 이어집니다. 세포는 최대 3 또는 4회 계대배양될 수 있다.
Introduction
망막 색소 상피 (RPE) 세포는 맥락막과 신경 망막 사이에 위치하여 광 수용체 (PR) 세포1 뒤에있는 직육면체 세포의 단순한 단층을 형성합니다. RPE는 주로 활성 산소 종(ROS)의 과도한 축적과 그에 따른 산화적 손상을 줄임으로써 PR 세포의 건강한 환경을 유지하는 데 중요한 역할을 합니다1. RPE 세포는 레티노이드의 전환 및 저장, 산란광의 흡수, 유체 및 이온 수송, 흘린 PR 외부 분절 막 2,3의 식균 작용과 같은 많은 기능을 감독합니다. RPE (형태 / 기능)의 변화는 망막 병증으로 이어지는 기능을 손상시킬 수 있으며 이는 많은 안구 질환에서 공유하는 공통적 인 특징입니다4. 많은 안구 질환은 색소성 망막염, Leber 선천성 무균증 및 백색증 4,5,6과 같은 일부 유전 질환뿐만 아니라 당뇨병성 망막병증(DR) 및 연령 관련 황반변성(AMD)과 같은 연령 관련 안구 질환을 포함하여 RPE 세포의 형태 및 기능의 변화와 관련이 있습니다.7,8 . 인간 세포가 가장 바람직하므로, RPE 단분자층을 형성하기 위한 1차 인간 RPE 세포에서 RPE 장애를 연구하는 것이 이상적일 것이다. 그러나, 윤리적 문제 및 이들 장애의 대부분이 이환율9을 유도하지만, 반드시 사망률10을 초래한다는 사실로 인한 인간 공여자의 제한된 이용가능성은 일차 인간 RPE 세포의 단리를 방지시킨다. 따라서 비인간 동물 기증자로부터 RPE 세포를 배양하는 것이 선호되는 대안입니다. 설치류, 특히 마우스는 트랜스 제닉 기술이이 종에서 더 광범위하게 확립되기 때문에 다양한 안구 질환을 연구하기위한 훌륭한 모델로 간주됩니다11. 배양된 1차 RPE 세포의 사용은 많은 이점을 제공하지만, 많은 계대 동안 성장하는 세포를 유지하거나 세포를 저장 및 재사용하는 것이 어려웠습니다. 이 프로토콜의 주요 한계는 생쥐의 나이입니다. RPE 분리에 사용되는 마우스는 성체 마우스 11,12,13에서 RPE 세포를 배양하는 것이 어려웠기 때문에 매우 어린 연령(18-21일이 최적임)이어야 합니다. RPE 세포는 모든 연령의 마우스 눈에서 분리 할 수 있지만 최대 4 개의 세포 계대는 어린 마우스 (18-21 일령)에서만 성공적이었습니다. RPE 세포에서 N-메틸-D-아스파르테이트 수용체(NMDAR)가 결실된 C57BL6 마우스와 트랜스제닉 마우스 모두를 사용하여 마우스 망막에서 RPE 분리를 수행하여 상승된 아미노산 호모시스테인이 AMD14의 발달 및 진행에 미치는 영향을 연구했습니다. 또한, 단리된 1차 RPE 세포는 RPE 세포14에서 NMDARs의 억제에 의해 AMD에 대한 치료 표적을 제안하는 것을 도왔다. 미국 식품의약국(FDA)의 승인을 받았으며 현재 AMD14의 잠재적 치료 표적이 될 수 있는 메만틴16과 같은 알츠하이머병(AD)과 관련된 중등도에서 중증의 혼란(치매) 치료에 사용되는 일부 NMDAR 차단제가 있습니다. 또한, 분리된 1차 마우스 RPE 세포는 염증 마커의 검출 및 높은 수준의 호모시스테인을 나타내는 유전자 변형 마우스(CBS)를 사용하여 AMD 및 AD의 호모시스테인 유도 기능에 대한 기본 메커니즘으로서 염증의 유도를 제안하는 데 사용되었습니다16,17.
이 프로토콜은 쉽게 적용 가능하고 신뢰할 수 있는 프로토콜에 도달하기 위해 공개된 다른 분리 프로토콜13,18,19의 단순화된 적응으로 우리 실험실에서 개발된 야생형 C57BL/6 마우스와 형질전환 마우스 모두에서 RPE 세포를 분리하는 데 사용되었습니다. 이 프로토콜에는 성별 선호도가 없습니다. 생쥐 연령이 분리 과정에 중요하지만, 어린 늙은 쥐(18-21일령)와 모든 연령(최대 12개월)의 나이든 쥐를 RPE 분리에 사용했습니다. 그러나 우리는 어린 생쥐에서 분리 된 RPE 세포가 더 오래 살았으며 최대 4 개의 계대를 수행 할 수 있음을 발견했습니다. 오래된 마우스에서 분리 된 RPE 세포는 한두 번 계대 할 수 있으며, 정상적인 속도로 성장을 멈추고 모양이 더 길쭉한 (섬유 아세포 유사 세포) 바뀝니다. 색소 침착의 손실 및 조직 배양 용기에 대한 접착력 감소에 이어 박리가 또한 관찰되었다.
Protocol
Representative Results
Discussion
현재 프로토콜은 마우스 눈에서 RPE 분리를 위해 보고, 수정 및 단순화된 세부 절차입니다. 이 프로토콜에는 마우스 눈에서 분리된 RPE 세포의 핵 제거, 해부, 수집, 파종, 배양 및 특성 분석이 포함됩니다.
성공적인 RPE 분리를 위해 충족해야 하는 몇 가지 제한 사항과 중요한 단계(예: 마우스 나이, 해부된 눈의 수, 조직 배양 접시 또는 접시의 크기, 파종, 보관 및 계대 배양 후 주…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작업은 국립 안과 연구소 (NEI), 국립 안과 연구소 (NEI) 기금 R01 EY029751-04의 지원을 받았습니다.
Materials
| Beaker : 100mL | KIMAX | 14000 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma-Aldrich | C7657-25MG | For working enzyme, A |
| Disposable Graduated Transfer Pipettes :3.2mL Sterile | 13-711-20 | ||
| DMEM/F12 | gibco | 11330 | Media to grow RPE cells |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | gibco | 26140079 | For complete RPE cell culture media |
| Gentamicin Reagent Solution | gibco | 15750-060 | For complete RPE cell culture media |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) | Thermo Scientific | 88284 | For working enzymes (A&B) |
| Heracell VISO 160i CO2 Incubator | Thermo Scientific | 50144906 | |
| Hyaluronidase from bovine testes | Sigma-Aldrich | H3506-500MG | For working enzyme A |
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 34155 | |
| Luer-Lok Syringe with attached needle 21 G x 1 1/2 in., sterile, single use, 3 mL | B-D | 309577 | |
| Micro Centrifuge Tube: 2 mL | Grainger | 11L819 | |
| Mouse monoclonal anti-RPE65 antibody | Abcam, Cambridge, MA, USA | ab78036 | For IF staining |
| Pen Strep | gibco | 15140-122 | For complete RPE cell culture media |
| Positive Action Tweezers, Style 5/45 | Dumont | 72703-DZ | |
| Scissors Iris Standard Straight 11.5cm | GARANA INDUSTRIES | 2595 | |
| Sorvall St8 Centrifuge | ThermoScientific | 75007200 | |
| Stemi 305 Microscope | Zeiss | n/a | |
| Surgical Blade, #11, Stainless Steel | Bard-Parker | 371211 | |
| Suspension Culture Dish 60mm x 15mm Style | Corning | 430589 | |
| Tissue Culture Dish : 100x20mm style | Corning | 353003 | |
| Tornado Tubes: 15mL | Midsci | C15B | |
| Tornado Tubes: 50mL | Midsci | C50R | |
| Trypsin EDTA (1x) 0.25% | gibco | 2186962 | For working enzyme B |
| Tweezers 5MS, 8.2cm, Straight, 0.09×0.05mm Tips | Dumont | 501764 | |
| Tweezers Positive Action Style 5, Biological, Dumostar, Polished Finish, 110 mm OAL | Electron Microscopy Sciences Dumont | 50-241-57 | |
| Underpads, Moderate : 23" X 36" | McKesson | 4033 | |
| Vannas Spring Scissors – 2.5mm Cutting Edge | FST | 15000-08 | |
| Zeiss AxioImager Z2 | Zeiss | n/a | |
| Zeiss Zen Blue 2.6 | Zeiss | n/a |
Riferimenti
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