Isolering av primære retinale retinale pigmenterte epitelceller
Summary
Dette manuskriptet beskriver en forenklet protokoll for isolering av retinale pigmenterte epitelceller (RPE) fra museøyne på en trinnvis måte. Protokollen inkluderer enukleasjon og disseksjon av museøyne, etterfulgt av isolering, såing og dyrking av RPE-celler.
Abstract
Det retinale pigmenterte epitellaget (RPE) ligger rett bak fotoreceptorene og har et komplekst metabolsk system som spiller flere kritiske roller for å opprettholde fotoreceptorenes funksjon. Dermed er RPE-strukturen og funksjonen avgjørende for å opprettholde normal syn. Dette manuskriptet presenterer en etablert protokoll for primær mus RPE-celleisolasjon. RPE-isolasjon er et flott verktøy for å undersøke de molekylære mekanismene som ligger til grunn for RPE-patologi i de forskjellige musemodellene av okulære lidelser. Videre kan RPE-isolasjon bidra til å sammenligne primære muse-RPE-celler isolert fra villtype og genetisk modifiserte mus, samt teste stoffer som kan akselerere utviklingen av terapi for synsforstyrrelser. Manuskriptet presenterer en trinnvis RPE-isolasjonsprotokoll; Hele prosedyren, fra enukleasjon til såing, tar omtrent 4 timer. Mediene bør ikke endres i 5-7 dager etter såing, for å tillate vekst av de isolerte cellene uten forstyrrelser. Denne prosessen etterfølges av karakterisering av morfologi, pigmentering og spesifikke markører i cellene via immunfluorescens. Celler kan passeres maksimalt tre eller fire ganger.
Introduction
Retinal pigmentert epitel (RPE) celler ligger mellom choroid og nevrale retina, og danner et enkelt monolag av kuboidale celler som ligger bak fotoreceptor (PR) celler1. RPE spiller en kritisk rolle i å opprettholde et sunt miljø for PR-celler, hovedsakelig ved å redusere overdreven akkumulering av reaktive oksygenarter (ROS) og påfølgende oksidativ skade1. RPE-celler overvåker mange funksjoner, for eksempel konvertering og lagring av retinoider, absorpsjon av spredt lys-, væske- og ionetransport og fagocytose av skur PR ytre segmentmembran 2,3. Endringer i RPE (morfologi / funksjon) kan svekke deres funksjon som fører til retinopati, og dette er et vanlig trekk som deles av mange okulære lidelser4. Mange okulære sykdommer er forbundet med endringer i morfologien og funksjonen til RPE-celler, inkludert noen genetiske sykdommer som retinitis pigmentosa, Leber medfødt amaurose og albinisme 4,5,6, samt aldersrelaterte okulære lidelser som diabetisk retinopati (DR) og aldersrelatert makuladegenerasjon (AMD)7,8 . Menneskelige celler er de mest ønskelige, og det ville derfor være ideelt å studere RPE-lidelser i primære menneskelige RPE-celler for å danne RPE-monolag. Etiske forhold og den begrensede tilgjengeligheten av menneskelige givere skyldes imidlertid at de fleste av disse lidelsene fører til sykelighet9, men ikke nødvendigvis dødelighet10, og forhindrer dermed isolering av primære humane RPE-celler. Dette gjør dyrking av RPE-celler fra ikke-menneskelige dyredonorer til et foretrukket alternativ. Gnagere, spesielt mus, regnes som en flott modell for å studere forskjellige okulære sykdommer siden transgen teknologi er mer omfattende etablert i disse artene11. Selv om bruken av dyrkede primære RPE-celler gir mange fordeler, har det vært vanskelig å opprettholde voksende celler i mange passasjer, eller å lagre og gjenbruke cellene. Hovedbegrensningen i denne protokollen er musens alder; mus som brukes til RPE-isolasjon bør være i svært ung alder (18-21 dager gammel er optimal) da det har vært vanskelig å dyrke RPE-celler fra voksne mus11,12,13. RPE-celler kan isoleres fra museøyne i alle aldre, men opptil fire cellepassasjer var bare vellykket med unge mus (18-21 dager gamle). RPE-isolasjon fra musehinner, ved bruk av både C57BL6-mus og transgene mus med delesjon av N-metyl-D-aspartatreseptorene (NMDARer) ved RPE-cellene, ble utført for å studere effekten av forhøyet aminosyrehomocystein på utvikling og progresjon av AMD14. I tillegg bidro isolerte primære RPE-celler til å foreslå et terapeutisk mål for AMD ved inhibering av NMDARene ved RPE-celler14. Det er noen NMDAR-blokkere som er godkjent av Food and Drug Administration (FDA) og brukes for tiden til å behandle moderat til alvorlig forvirring (demens) relatert til Alzheimers sykdom (AD), for eksempel memantin16, som kan være et potensielt terapeutisk mål for AMD14. Videre ble isolerte primære muse-RPE-celler brukt til påvisning av inflammatoriske markører og den foreslåtte induksjonen av betennelse som en underliggende mekanisme for homocysteininduserte egenskaper av AMD og AD ved hjelp av en genetisk modifisert mus (CBS), som presenterer et høyt nivå av homocystein16,17.
Denne protokollen ble brukt til å isolere RPE-celler fra både villtype C57BL / 6-mus og transgene mus utviklet i vårt laboratorium som en forenklet tilpasning av andre publiserte isolasjonsprotokoller13,18,19 for å nå en lett anvendelig og pålitelig protokoll. Det er ingen kjønnspreferanse i denne protokollen. Mens musealder er kritiske for isolasjonsprosessen, ble unge, eldre mus (18-21 dager gamle) og eldre mus i alle aldre (opptil 12 måneder) brukt til RPE-isolasjon. Vi la imidlertid merke til at RPE-cellene isolert fra de unge musene levde lenger, og opptil fire passasjer kunne utføres. RPE-cellene isolert fra eldre mus kunne passeres en eller to ganger, da ville de slutte å vokse med normal hastighet og endre form for å bli lengre (fibroblastlignende celler). Tap av pigmentering og redusert vedheft til vevskulturplaten etterfulgt av løsrivelse ble også observert.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den nåværende protokollen er en rapportert, modifisert og forenklet detaljert prosedyre for RPE-isolasjon fra museøyne. Protokollen inkluderer enukleasjon, disseksjon, innsamling, såing, kultur og karakterisering av RPE-celler isolert fra museøyne.
Det er noen begrensninger og kritiske trinn som må oppfylles for vellykket RPE-isolasjon, for eksempel musealder, antall øyne dissekert, størrelsen på vevskulturplaten eller parabolen, og forsiktighetsregler etter såing, lagring og passeri…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av National Eye Institute (NEI), National Eye Institute (NEI) fond R01 EY029751-04
Materials
| Beaker : 100mL | KIMAX | 14000 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma-Aldrich | C7657-25MG | For working enzyme, A |
| Disposable Graduated Transfer Pipettes :3.2mL Sterile | 13-711-20 | ||
| DMEM/F12 | gibco | 11330 | Media to grow RPE cells |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | gibco | 26140079 | For complete RPE cell culture media |
| Gentamicin Reagent Solution | gibco | 15750-060 | For complete RPE cell culture media |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) | Thermo Scientific | 88284 | For working enzymes (A&B) |
| Heracell VISO 160i CO2 Incubator | Thermo Scientific | 50144906 | |
| Hyaluronidase from bovine testes | Sigma-Aldrich | H3506-500MG | For working enzyme A |
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 34155 | |
| Luer-Lok Syringe with attached needle 21 G x 1 1/2 in., sterile, single use, 3 mL | B-D | 309577 | |
| Micro Centrifuge Tube: 2 mL | Grainger | 11L819 | |
| Mouse monoclonal anti-RPE65 antibody | Abcam, Cambridge, MA, USA | ab78036 | For IF staining |
| Pen Strep | gibco | 15140-122 | For complete RPE cell culture media |
| Positive Action Tweezers, Style 5/45 | Dumont | 72703-DZ | |
| Scissors Iris Standard Straight 11.5cm | GARANA INDUSTRIES | 2595 | |
| Sorvall St8 Centrifuge | ThermoScientific | 75007200 | |
| Stemi 305 Microscope | Zeiss | n/a | |
| Surgical Blade, #11, Stainless Steel | Bard-Parker | 371211 | |
| Suspension Culture Dish 60mm x 15mm Style | Corning | 430589 | |
| Tissue Culture Dish : 100x20mm style | Corning | 353003 | |
| Tornado Tubes: 15mL | Midsci | C15B | |
| Tornado Tubes: 50mL | Midsci | C50R | |
| Trypsin EDTA (1x) 0.25% | gibco | 2186962 | For working enzyme B |
| Tweezers 5MS, 8.2cm, Straight, 0.09×0.05mm Tips | Dumont | 501764 | |
| Tweezers Positive Action Style 5, Biological, Dumostar, Polished Finish, 110 mm OAL | Electron Microscopy Sciences Dumont | 50-241-57 | |
| Underpads, Moderate : 23" X 36" | McKesson | 4033 | |
| Vannas Spring Scissors – 2.5mm Cutting Edge | FST | 15000-08 | |
| Zeiss AxioImager Z2 | Zeiss | n/a | |
| Zeiss Zen Blue 2.6 | Zeiss | n/a |
Riferimenti
- Young, R. W., Droz, B. The renewal of protein in retinal rods and cones. The Journal of Cell Biology. 39 (1), 169-184 (1968).
- Sparrow, J. R., Hicks, D., Hamel, C. P. The retinal pigment epithelium in health and disease. Current Molecular Medicine. 10 (9), 802-823 (2010).
- Strauss, O. The retinal pigment epithelium in visual function. Physiological Reviews. 85 (3), 845-881 (2005).
- Marlhens, F., et al. Autosomal recessive retinal dystrophy associated with two novel mutations in the RPE65 gene. European Journal of Human Genetics. 6 (5), 527-531 (1998).
- Morimura, H., et al. Mutations in the RPE65 gene in patients with autosomal recessive retinitis pigmentosa or leber congenital amaurosis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 95 (6), 3088-3093 (1998).
- Weiter, J. J., Delori, F. C., Wing, G. L., Fitch, K. A. Retinal pigment epithelial lipofuscin and melanin and choroidal melanin in human eyes. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 27 (2), 145-152 (1986).
- Feeney-Burns, L., Hilderbrand, E. S., Eldridge, S. Aging human RPE: morphometric analysis of macular, equatorial, and peripheral cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 25 (2), 195-200 (1984).
- Ibrahim, A. S., et al. Hyperhomocysteinemia disrupts retinal pigment epithelial structure and function with features of age-related macular degeneration. Oncotarget. 7 (8), 8532-8545 (2016).
- Zarbin, M. A. Age-related macular degeneration: review of pathogenesis. European Journal of Ophthalmology. 8 (4), 199-206 (1998).
- Dunn, K. C., Aotaki-Keen, A. E., Putkey, F. R., Hjelmeland, L. M. ARPE-19, a human retinal pigment epithelial cell line with differentiated properties. Experimental Eye Research. 62 (2), 155-170 (1996).
- Flannery, J. G. Transgenic animal models for the study of inherited retinal dystrophies. ILAR Journal. 40 (2), 51-58 (1999).
- Gibbs, D., Williams, D. S. Isolation and culture of primary mouse retinal pigmented epithelial cells. Advances in Experimental Medicine and Biology. 533, 347-352 (2003).
- Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. Isolation, culture, and characterization of primary mouse RPE cells. Nature Protocols. 11 (7), 1206-1218 (2016).
- Samra, Y. A., et al. Implication of N-Methyl-d-Aspartate receptor in homocysteine-induced age-related macular degeneration. International Journal of Molecular Sciences. 22 (17), 9356 (2021).
- van Marum, R. J. Update on the use of memantine in Alzheimer’s disease. Neuropsychiatric Disease and Treatment. 5, 237-247 (2009).
- Elsherbiny, N. M., et al. Homocysteine induces inflammation in retina and brain. Biomolecules. 10 (3), 393 (2020).
- Tawfik, A., Elsherbiny, N. M., Zaidi, Y., Rajpurohit, P. Homocysteine and age-related central nervous system diseases: role of inflammation. International Journal of Molecular Sciences. 22 (12), 6259 (2021).
- Shang, P., Stepicheva, N. A., Hose, S., Zigler Jr, J. S., Sinha, D. Primary cell cultures from the mouse retinal pigment epithelium. Journal of Visualized Experiments. (133), e56997 (2018).
- Chen, M., et al. Characterization of a spontaneous mouse retinal pigment epithelial cell line B6-RPE07. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 49 (8), 3699-3706 (2008).
- AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2020 Edition. Available from: https://www.avma.org/KB/Policies/Documents/euthanasia.pdf (2020)
- Cai, X., Conley, S. M., Naash, M. I. RPE65: role in the visual cycle, human retinal disease, and gene therapy. Ophthalmic Genetics. 30 (2), 57-62 (2009).
- Pérez-Álvarez, M. J., et al. Vimentin isoform expression in the human retina characterized with the monoclonal antibody 3CB2. Journal of Neuroscience Research. 86 (8), 1871-1883 (2008).
- Tawfik, A., Samra, Y. A., Elsherbiny, N. M., Al-Shabrawey, M. Implication of hyperhomocysteinemia in blood retinal barrier (BRB) dysfunction. Biomolecules. 10 (8), 1119 (2020).
- Promsote, W., Makala, L., Li, B., Smith, S. B., Singh, N., Ganapathy, V., Pace, B. S., Martin, P. Monomethylfumarate induces γ-globin expression and fetal hemoglobin production in cultured human retinal pigment epithelial (RPE) and erythroid cells, and in intact retina. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (8), 5382-5393 (2014).
