Isolierung von primären retinalen pigmentierten Epithelzellen der Maus
Summary
Dieses Manuskript beschreibt ein vereinfachtes Protokoll zur schrittweisen Isolierung von retinalen pigmentierten Epithelzellen (RPE) aus Mausaugen. Das Protokoll umfasst die Enukleation und Dissektion von Mausaugen, gefolgt von der Isolierung, Aussaat und Kultivierung von RPE-Zellen.
Abstract
Die retinale pigmentierte Epithelschicht (RPE) liegt unmittelbar hinter den Photorezeptoren und beherbergt ein komplexes Stoffwechselsystem, das mehrere entscheidende Rollen bei der Aufrechterhaltung der Funktion der Photorezeptoren spielt. Daher sind die RPE-Struktur und -Funktion unerlässlich, um ein normales Sehvermögen aufrechtzuerhalten. Dieses Manuskript stellt ein etabliertes Protokoll für die primäre RPE-Zellisolierung von Mäusen vor. Die RPE-Isolierung ist ein großartiges Werkzeug, um die molekularen Mechanismen zu untersuchen, die der RPE-Pathologie in den verschiedenen Mausmodellen für Augenerkrankungen zugrunde liegen. Darüber hinaus kann die RPE-Isolierung helfen, primäre Maus-RPE-Zellen zu vergleichen, die aus Wildtyp- und genetisch veränderten Mäusen isoliert wurden, sowie Medikamente zu testen, die die Entwicklung von Therapien für Sehstörungen beschleunigen können. Das Manuskript stellt ein schrittweises RPE-Isolationsprotokoll vor; Der gesamte Vorgang von der Enukleation bis zur Aussaat dauert ca. 4 Stunden. Das Medium sollte 5-7 Tage nach der Aussaat nicht gewechselt werden, damit die isolierten Zellen ungestört wachsen können. Diesem Prozess folgt die Charakterisierung von Morphologie, Pigmentierung und spezifischen Markern in den Zellen mittels Immunfluoreszenz. Zellen können maximal drei- oder viermal durchlaufen werden.
Introduction
Retinale pigmentierte Epithelzellen (RPE) befinden sich zwischen der Aderhaut und der neuronalen Netzhaut und bilden eine einfache Monoschicht von quaderförmigen Zellen, die hinter den Photorezeptorzellen (PR) liegen1. Das RPE spielt eine entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung einer gesunden Umgebung für PR-Zellen, hauptsächlich durch die Verringerung der übermäßigen Anhäufung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) und der daraus resultierenden oxidativen Schäden1. RPE-Zellen überwachen viele Funktionen, wie die Umwandlung und Speicherung von Retinoide, die Absorption von Streulicht, den Flüssigkeits- und Ionentransport und die Phagozytose der abgestoßenen PR-Außensegmentmembran 2,3. Veränderungen in der RPE (Morphologie/Funktion) können ihre Funktion beeinträchtigen und zu einer Retinopathie führen, und dies ist ein gemeinsames Merkmal vieler Augenerkrankungen4. Viele Augenerkrankungen sind mit Veränderungen in der Morphologie und Funktion von RPE-Zellen verbunden, darunter einige genetische Erkrankungen wie Retinitis pigmentosa, Lebersche kongenitale Amaurose und Albinismus 4,5,6 sowie altersbedingte Augenerkrankungen wie diabetische Retinopathie (DR) und altersbedingte Makuladegeneration (AMD)7,8 . Menschliche Zellen sind am wünschenswertesten, daher wäre es ideal, RPE-Störungen in primären menschlichen RPE-Zellen zur Bildung von RPE-Monoschichten zu untersuchen. Ethische Fragen und die begrenzte Verfügbarkeit menschlicher Spender aufgrund der Tatsache, dass die meisten dieser Störungen zu Morbiditätführen 9, aber nicht unbedingt zur Mortalität10, verhindern dadurch die Isolierung primärer humaner RPE-Zellen. Dies macht die Kultivierung von RPE-Zellen von nichtmenschlichen Tierspendern zu einer bevorzugten Alternative. Nagetiere, insbesondere Mäuse, gelten als hervorragendes Modell für die Untersuchung verschiedener Augenerkrankungen, da die transgene Technologie bei diesen Arten weiter verbreitet ist11. Obwohl die Verwendung von kultivierten primären RPE-Zellen viele Vorteile bietet, war es schwierig, wachsende Zellen für viele Passagen aufrechtzuerhalten oder die Zellen zu speichern und wiederzuverwenden. Die Haupteinschränkung dieses Protokolls ist das Alter der Mäuse; Mäuse, die für die RPE-Isolierung verwendet werden, sollten ein sehr junges Alter haben (18-21 Tage alt ist optimal), da es schwierig war, RPE-Zellen von erwachsenen Mäusen zu kultivieren11,12,13. RPE-Zellen können in jedem Alter aus Mausaugen isoliert werden, jedoch waren bis zu vier Zellpassagen nur bei jungen Mäusen (18-21 Tage alt) erfolgreich. Die RPE-Isolierung aus Mausnetzhäuten unter Verwendung von C57BL6-Mäusen und transgenen Mäusen mit Deletion der N-Methyl-D-Aspartatrezeptoren (NMDARs) an den RPE-Zellen wurde durchgeführt, um die Wirkung von erhöhtem Aminosäure-Homocystein auf die Entwicklung und das Fortschreiten von AMD14 zu untersuchen. Darüber hinaus halfen isolierte primäre RPE-Zellen dabei, ein therapeutisches Ziel für AMD vorzuschlagen, indem sie die NMDARs an RPE-Zellen hemmten14. Es gibt einige NMDAR-Blocker, die von der Food and Drug Administration (FDA) zugelassen sind und derzeit zur Behandlung von mittelschwerer bis schwerer Verwirrung (Demenz) im Zusammenhang mit der Alzheimer-Krankheit (AD) eingesetzt werden, wie Memantin16, das ein potenzielles therapeutisches Ziel für AMD14 sein könnte. Darüber hinaus wurden isolierte primäre Maus-RPE-Zellen für den Nachweis von Entzündungsmarkern und die vorgeschlagene Induktion von Entzündungen als zugrunde liegenden Mechanismus für Homocystein-induzierte Merkmale von AMD und AD unter Verwendung einer genetisch veränderten Maus (CBS) verwendet, die einen hohen Homocysteinspiegel aufweist16,17.
Dieses Protokoll wurde verwendet, um RPE-Zellen sowohl von Wildtyp-C57BL/6-Mäusen als auch von transgenen Mäusen zu isolieren, die in unserem Labor als vereinfachte Anpassung anderer veröffentlichter Isolationsprotokolle13,18,19 entwickelt wurden, um ein leicht anwendbares und zuverlässiges Protokoll zu erreichen. Es gibt keine Geschlechtspräferenz in diesem Protokoll. Während das Alter der Mäuse für den Isolationsprozess entscheidend ist, wurden junge, ältere Mäuse (18-21 Tage alt) und ältere Mäuse in jedem Alter (bis zu 12 Monate) für die RPE-Isolierung verwendet. Wir stellten jedoch fest, dass die RPE-Zellen, die aus den jungen Mäusen isoliert wurden, länger lebten und bis zu vier Passagen durchgeführt werden konnten. Die RPE-Zellen, die aus älteren Mäusen isoliert wurden, könnten ein- oder zweimal durchquert werden, dann würden sie aufhören zu wachsen und ihre Form ändern, um länglicher zu sein (Fibroblasten-ähnliche Zellen). Ein Verlust der Pigmentierung und eine verminderte Adhäsion an der Gewebekulturplatte, gefolgt von einer Ablösung, wurden ebenfalls beobachtet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das aktuelle Protokoll ist ein berichtetes, modifiziertes und vereinfachtes detailliertes Verfahren zur RPE-Isolierung von Mausaugen. Das Protokoll umfasst Enukleation, Dissektion, Sammlung, Seeding, Kultur und Charakterisierung von RPE-Zellen, die aus Mausaugen isoliert wurden.
Es gibt einige Einschränkungen und kritische Schritte, die für eine erfolgreiche RPE-Isolierung erfüllt werden müssen, z. B. das Alter der Mäuse, die Anzahl der sezierten Augen, die Größe der Gewebekulturplatte …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde unterstützt durch das National Eye Institute (NEI), National Eye Institute (NEI) Fonds R01 EY029751-04
Materials
| Beaker : 100mL | KIMAX | 14000 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma-Aldrich | C7657-25MG | For working enzyme, A |
| Disposable Graduated Transfer Pipettes :3.2mL Sterile | 13-711-20 | ||
| DMEM/F12 | gibco | 11330 | Media to grow RPE cells |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | gibco | 26140079 | For complete RPE cell culture media |
| Gentamicin Reagent Solution | gibco | 15750-060 | For complete RPE cell culture media |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) | Thermo Scientific | 88284 | For working enzymes (A&B) |
| Heracell VISO 160i CO2 Incubator | Thermo Scientific | 50144906 | |
| Hyaluronidase from bovine testes | Sigma-Aldrich | H3506-500MG | For working enzyme A |
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 34155 | |
| Luer-Lok Syringe with attached needle 21 G x 1 1/2 in., sterile, single use, 3 mL | B-D | 309577 | |
| Micro Centrifuge Tube: 2 mL | Grainger | 11L819 | |
| Mouse monoclonal anti-RPE65 antibody | Abcam, Cambridge, MA, USA | ab78036 | For IF staining |
| Pen Strep | gibco | 15140-122 | For complete RPE cell culture media |
| Positive Action Tweezers, Style 5/45 | Dumont | 72703-DZ | |
| Scissors Iris Standard Straight 11.5cm | GARANA INDUSTRIES | 2595 | |
| Sorvall St8 Centrifuge | ThermoScientific | 75007200 | |
| Stemi 305 Microscope | Zeiss | n/a | |
| Surgical Blade, #11, Stainless Steel | Bard-Parker | 371211 | |
| Suspension Culture Dish 60mm x 15mm Style | Corning | 430589 | |
| Tissue Culture Dish : 100x20mm style | Corning | 353003 | |
| Tornado Tubes: 15mL | Midsci | C15B | |
| Tornado Tubes: 50mL | Midsci | C50R | |
| Trypsin EDTA (1x) 0.25% | gibco | 2186962 | For working enzyme B |
| Tweezers 5MS, 8.2cm, Straight, 0.09×0.05mm Tips | Dumont | 501764 | |
| Tweezers Positive Action Style 5, Biological, Dumostar, Polished Finish, 110 mm OAL | Electron Microscopy Sciences Dumont | 50-241-57 | |
| Underpads, Moderate : 23" X 36" | McKesson | 4033 | |
| Vannas Spring Scissors – 2.5mm Cutting Edge | FST | 15000-08 | |
| Zeiss AxioImager Z2 | Zeiss | n/a | |
| Zeiss Zen Blue 2.6 | Zeiss | n/a |
Riferimenti
- Young, R. W., Droz, B. The renewal of protein in retinal rods and cones. The Journal of Cell Biology. 39 (1), 169-184 (1968).
- Sparrow, J. R., Hicks, D., Hamel, C. P. The retinal pigment epithelium in health and disease. Current Molecular Medicine. 10 (9), 802-823 (2010).
- Strauss, O. The retinal pigment epithelium in visual function. Physiological Reviews. 85 (3), 845-881 (2005).
- Marlhens, F., et al. Autosomal recessive retinal dystrophy associated with two novel mutations in the RPE65 gene. European Journal of Human Genetics. 6 (5), 527-531 (1998).
- Morimura, H., et al. Mutations in the RPE65 gene in patients with autosomal recessive retinitis pigmentosa or leber congenital amaurosis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 95 (6), 3088-3093 (1998).
- Weiter, J. J., Delori, F. C., Wing, G. L., Fitch, K. A. Retinal pigment epithelial lipofuscin and melanin and choroidal melanin in human eyes. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 27 (2), 145-152 (1986).
- Feeney-Burns, L., Hilderbrand, E. S., Eldridge, S. Aging human RPE: morphometric analysis of macular, equatorial, and peripheral cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 25 (2), 195-200 (1984).
- Ibrahim, A. S., et al. Hyperhomocysteinemia disrupts retinal pigment epithelial structure and function with features of age-related macular degeneration. Oncotarget. 7 (8), 8532-8545 (2016).
- Zarbin, M. A. Age-related macular degeneration: review of pathogenesis. European Journal of Ophthalmology. 8 (4), 199-206 (1998).
- Dunn, K. C., Aotaki-Keen, A. E., Putkey, F. R., Hjelmeland, L. M. ARPE-19, a human retinal pigment epithelial cell line with differentiated properties. Experimental Eye Research. 62 (2), 155-170 (1996).
- Flannery, J. G. Transgenic animal models for the study of inherited retinal dystrophies. ILAR Journal. 40 (2), 51-58 (1999).
- Gibbs, D., Williams, D. S. Isolation and culture of primary mouse retinal pigmented epithelial cells. Advances in Experimental Medicine and Biology. 533, 347-352 (2003).
- Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. Isolation, culture, and characterization of primary mouse RPE cells. Nature Protocols. 11 (7), 1206-1218 (2016).
- Samra, Y. A., et al. Implication of N-Methyl-d-Aspartate receptor in homocysteine-induced age-related macular degeneration. International Journal of Molecular Sciences. 22 (17), 9356 (2021).
- van Marum, R. J. Update on the use of memantine in Alzheimer’s disease. Neuropsychiatric Disease and Treatment. 5, 237-247 (2009).
- Elsherbiny, N. M., et al. Homocysteine induces inflammation in retina and brain. Biomolecules. 10 (3), 393 (2020).
- Tawfik, A., Elsherbiny, N. M., Zaidi, Y., Rajpurohit, P. Homocysteine and age-related central nervous system diseases: role of inflammation. International Journal of Molecular Sciences. 22 (12), 6259 (2021).
- Shang, P., Stepicheva, N. A., Hose, S., Zigler Jr, J. S., Sinha, D. Primary cell cultures from the mouse retinal pigment epithelium. Journal of Visualized Experiments. (133), e56997 (2018).
- Chen, M., et al. Characterization of a spontaneous mouse retinal pigment epithelial cell line B6-RPE07. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 49 (8), 3699-3706 (2008).
- AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2020 Edition. Available from: https://www.avma.org/KB/Policies/Documents/euthanasia.pdf (2020)
- Cai, X., Conley, S. M., Naash, M. I. RPE65: role in the visual cycle, human retinal disease, and gene therapy. Ophthalmic Genetics. 30 (2), 57-62 (2009).
- Pérez-Álvarez, M. J., et al. Vimentin isoform expression in the human retina characterized with the monoclonal antibody 3CB2. Journal of Neuroscience Research. 86 (8), 1871-1883 (2008).
- Tawfik, A., Samra, Y. A., Elsherbiny, N. M., Al-Shabrawey, M. Implication of hyperhomocysteinemia in blood retinal barrier (BRB) dysfunction. Biomolecules. 10 (8), 1119 (2020).
- Promsote, W., Makala, L., Li, B., Smith, S. B., Singh, N., Ganapathy, V., Pace, B. S., Martin, P. Monomethylfumarate induces γ-globin expression and fetal hemoglobin production in cultured human retinal pigment epithelial (RPE) and erythroid cells, and in intact retina. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (8), 5382-5393 (2014).
