Primer Fare Retinal Pigmentli Epitel Hücrelerinin İzolasyonu
Summary
Bu yazıda retinal pigmente epitel (RPE) hücrelerinin fare gözlerinden kademeli olarak izole edilmesi için basitleştirilmiş bir protokol anlatılmaktadır. Protokol, fare gözlerinin enükleasyonunu ve diseksiyonunu, ardından RPE hücrelerinin izolasyonunu, tohumlanmasını ve kültürlenmesini içerir.
Abstract
Retinal pigmentli epitel (RPE) tabakası, fotoreseptörlerin hemen arkasında yer alır ve fotoreseptörlerin işlevini sürdürmede birkaç kritik rol oynayan karmaşık bir metabolik sistemi barındırır. Bu nedenle, RPE yapısı ve işlevi normal görüşü sürdürmek için gereklidir. Bu yazıda primer fare RPE hücre izolasyonu için belirlenmiş bir protokol sunulmaktadır. RPE izolasyonu, oküler bozuklukların farklı fare modellerinde RPE patolojisinin altında yatan moleküler mekanizmaları araştırmak için harika bir araçtır. Ayrıca, RPE izolasyonu, vahşi tip ve genetiği değiştirilmiş farelerden izole edilen birincil fare RPE hücrelerinin karşılaştırılmasında ve görme bozuklukları için tedavinin gelişimini hızlandırabilecek ilaçların test edilmesinde yardımcı olabilir. Makale adım adım RPE izolasyon protokolü sunmaktadır; enükleasyondan tohumlamaya kadar tüm prosedür yaklaşık 4 saat sürer. İzole hücrelerin bozulmadan büyümesine izin vermek için tohumlamadan sonra 5-7 gün boyunca ortam değiştirilmemelidir. Bu süreci, immünofloresan yoluyla hücrelerdeki morfoloji, pigmentasyon ve spesifik belirteçlerin karakterizasyonu izler. Hücreler en fazla üç veya dört kez geçirilebilir.
Introduction
Retinal pigmentli epitel (RPE) hücreleri, koroid ve nöral retina arasında bulunur ve fotoreseptör (PR) hücrelerinin arkasında yatan basit bir küboidal hücre tabakası oluşturur1. RPE, PR hücreleri için sağlıklı bir ortamın korunmasında, esas olarak reaktif oksijen türlerinin (ROS) aşırı birikimini ve bunun sonucunda oksidatif hasarı azaltarak kritik bir rol oynar1. RPE hücreleri, retinoidlerin dönüşümü ve depolanması, dağınık ışığın emilimi, sıvı ve iyon taşınması ve dökülen PR dış segment membranının fagositozu 2,3 gibi birçok işlevi denetler. RPE’deki değişiklikler (morfoloji/fonksiyon) retinopatiye yol açan fonksiyonlarını bozabilir ve bu birçok oküler bozukluk tarafından paylaşılan ortak bir özelliktir4. Birçok oküler hastalık, retinitis pigmentosa, Leber konjenital amauroz ve albinizm 4,5,6 gibi bazı genetik hastalıkların yanı sıra diyabetik retinopati (DR) ve yaşa bağlı makula dejenerasyonu (AMD) gibi yaşa bağlı oküler bozukluklar da dahil olmak üzere RPE hücrelerinin morfolojisi ve fonksiyonundaki değişikliklerle ilişkilidir7,8 . İnsan hücreleri en çok arzu edilenlerdir, bu nedenle RPE monokatmanları oluşturmak için birincil insan RPE hücrelerindeki RPE bozukluklarını incelemek ideal olacaktır. Bununla birlikte, etik konular ve bu bozuklukların çoğunun morbiditeye yol açması nedeniyle insan donörlerinin sınırlı mevcudiyeti9, ancak mutlaka mortalite10 değil, böylece birincil insan RPE hücrelerinin izolasyonunu engellemektedir. Bu, insan olmayan hayvan donörlerinden RPE hücrelerinin kültürlenmesini tercih edilen bir alternatif haline getirir. Kemirgenler, özellikle fareler, farklı oküler hastalıkları incelemek için harika bir model olarak kabul edilir, çünkü transgenik teknoloji bu türlerde daha yaygın olarak kurulmuştur11. Kültürlenmiş primer RPE hücrelerinin kullanımı birçok avantaj sunsa da, birçok pasaj için büyüyen hücreleri korumak veya hücreleri depolamak ve yeniden kullanmak zor olmuştur. Bu protokolün ana sınırlaması farelerin yaşıdır; RPE izolasyonu için kullanılan fareler çok genç yaşta olmalıdır (18-21 günlüklük en uygunudur), çünkü yetişkin farelerden RPE hücrelerini kültürlemek zor olmuştur11,12,13. RPE hücreleri her yaşta fare gözlerinden izole edilebilir, ancak dört hücreye kadar pasaj sadece genç farelerde (18-21 günlük) başarılı olmuştur. RPE hücrelerinde N-metil-D-aspartat reseptörlerinin (NMDAR’lar) silinmesiyle hem C57BL6 fareleri hem de transgenik fareler kullanılarak fare retinalarından RPE izolasyonu, yüksek amino asit homosisteinin AMD14’ün gelişimi ve ilerlemesi üzerindeki etkisini incelemek için gerçekleştirildi. Ek olarak, izole primer RPE hücreleri, RPE hücrelerinde NMDAR’ların inhibisyonu ile AMD için terapötik bir hedef önerilmesine yardımcı oldu14. Gıda ve İlaç İdaresi (FDA) tarafından onaylanan ve şu anda AMD14 için potansiyel bir terapötik hedef olabilecek memantin16 gibi Alzheimer hastalığına (AD) bağlı orta ila şiddetli karışıklığı (demans) tedavi etmek için kullanılan bazı NMDAR blokerleri vardır. Ayrıca, izole primer fare RPE hücreleri, enflamatuar belirteçlerin tespiti ve yüksek düzeyde homosistein16,17 sunan genetiği değiştirilmiş bir fare (CBS) kullanılarak AMD ve AD’nin homosistein kaynaklı özellikleri için altta yatan bir mekanizma olarak inflamasyonun önerilen indüksiyonu için kullanılmıştır.
Bu protokol, RPE hücrelerini hem vahşi tip C57BL / 6 farelerden hem de laboratuvarımızda geliştirilen transgenik farelerden, kolayca uygulanabilir ve güvenilir bir protokole ulaşmak için diğer yayınlanmış izolasyon protokollerinin 13,18,19’unun basitleştirilmiş bir uyarlaması olarak izole etmek için kullanılmıştır. Bu protokolde cinsiyet tercihi yoktur. Farelerin yaşları izolasyon süreci için kritik öneme sahipken, RPE izolasyonu için genç, yaşlı fareler (18-21 günlük) ve herhangi bir yaştaki (12 aya kadar) yaşlı fareler kullanılmıştır. Bununla birlikte, genç yaşlı farelerden izole edilen RPE hücrelerinin daha uzun yaşadığını ve dört pasajın gerçekleştirilebileceğini fark ettik. Yaşlı farelerden izole edilen RPE hücreleri bir veya iki kez geçirilebilir, daha sonra normal bir oranda büyümeyi durdurur ve şekillerini daha uzun olacak şekilde değiştirirler (fibroblast benzeri hücreler). Pigmentasyon kaybı ve doku kültürü plağına yapışmanın azalması ve ardından dekolmanı da gözlendi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Geçerli protokol, fare gözlerinden RPE yalıtımı için raporlanmış, değiştirilmiş ve basitleştirilmiş ayrıntılı bir yordamdır. Protokol, fare gözlerinden izole edilen RPE hücrelerinin enükleasyonu, diseksiyonu, toplanması, tohumlanması, kültürü ve karakterizasyonunu içerir.
Başarılı RPE izolasyonu için farelerin yaşı, disseke edilen göz sayısı, doku kültürü tabağının veya kabının büyüklüğü ve tohumlama, depolama ve pasajdan sonra uyarılar gibi yer…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Ulusal Göz Enstitüsü (NEI), Ulusal Göz Enstitüsü (NEI) fonu R01 EY029751-04 tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Beaker : 100mL | KIMAX | 14000 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma-Aldrich | C7657-25MG | For working enzyme, A |
| Disposable Graduated Transfer Pipettes :3.2mL Sterile | 13-711-20 | ||
| DMEM/F12 | gibco | 11330 | Media to grow RPE cells |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | gibco | 26140079 | For complete RPE cell culture media |
| Gentamicin Reagent Solution | gibco | 15750-060 | For complete RPE cell culture media |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) | Thermo Scientific | 88284 | For working enzymes (A&B) |
| Heracell VISO 160i CO2 Incubator | Thermo Scientific | 50144906 | |
| Hyaluronidase from bovine testes | Sigma-Aldrich | H3506-500MG | For working enzyme A |
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 34155 | |
| Luer-Lok Syringe with attached needle 21 G x 1 1/2 in., sterile, single use, 3 mL | B-D | 309577 | |
| Micro Centrifuge Tube: 2 mL | Grainger | 11L819 | |
| Mouse monoclonal anti-RPE65 antibody | Abcam, Cambridge, MA, USA | ab78036 | For IF staining |
| Pen Strep | gibco | 15140-122 | For complete RPE cell culture media |
| Positive Action Tweezers, Style 5/45 | Dumont | 72703-DZ | |
| Scissors Iris Standard Straight 11.5cm | GARANA INDUSTRIES | 2595 | |
| Sorvall St8 Centrifuge | ThermoScientific | 75007200 | |
| Stemi 305 Microscope | Zeiss | n/a | |
| Surgical Blade, #11, Stainless Steel | Bard-Parker | 371211 | |
| Suspension Culture Dish 60mm x 15mm Style | Corning | 430589 | |
| Tissue Culture Dish : 100x20mm style | Corning | 353003 | |
| Tornado Tubes: 15mL | Midsci | C15B | |
| Tornado Tubes: 50mL | Midsci | C50R | |
| Trypsin EDTA (1x) 0.25% | gibco | 2186962 | For working enzyme B |
| Tweezers 5MS, 8.2cm, Straight, 0.09×0.05mm Tips | Dumont | 501764 | |
| Tweezers Positive Action Style 5, Biological, Dumostar, Polished Finish, 110 mm OAL | Electron Microscopy Sciences Dumont | 50-241-57 | |
| Underpads, Moderate : 23" X 36" | McKesson | 4033 | |
| Vannas Spring Scissors – 2.5mm Cutting Edge | FST | 15000-08 | |
| Zeiss AxioImager Z2 | Zeiss | n/a | |
| Zeiss Zen Blue 2.6 | Zeiss | n/a |
Riferimenti
- Young, R. W., Droz, B. The renewal of protein in retinal rods and cones. The Journal of Cell Biology. 39 (1), 169-184 (1968).
- Sparrow, J. R., Hicks, D., Hamel, C. P. The retinal pigment epithelium in health and disease. Current Molecular Medicine. 10 (9), 802-823 (2010).
- Strauss, O. The retinal pigment epithelium in visual function. Physiological Reviews. 85 (3), 845-881 (2005).
- Marlhens, F., et al. Autosomal recessive retinal dystrophy associated with two novel mutations in the RPE65 gene. European Journal of Human Genetics. 6 (5), 527-531 (1998).
- Morimura, H., et al. Mutations in the RPE65 gene in patients with autosomal recessive retinitis pigmentosa or leber congenital amaurosis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 95 (6), 3088-3093 (1998).
- Weiter, J. J., Delori, F. C., Wing, G. L., Fitch, K. A. Retinal pigment epithelial lipofuscin and melanin and choroidal melanin in human eyes. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 27 (2), 145-152 (1986).
- Feeney-Burns, L., Hilderbrand, E. S., Eldridge, S. Aging human RPE: morphometric analysis of macular, equatorial, and peripheral cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 25 (2), 195-200 (1984).
- Ibrahim, A. S., et al. Hyperhomocysteinemia disrupts retinal pigment epithelial structure and function with features of age-related macular degeneration. Oncotarget. 7 (8), 8532-8545 (2016).
- Zarbin, M. A. Age-related macular degeneration: review of pathogenesis. European Journal of Ophthalmology. 8 (4), 199-206 (1998).
- Dunn, K. C., Aotaki-Keen, A. E., Putkey, F. R., Hjelmeland, L. M. ARPE-19, a human retinal pigment epithelial cell line with differentiated properties. Experimental Eye Research. 62 (2), 155-170 (1996).
- Flannery, J. G. Transgenic animal models for the study of inherited retinal dystrophies. ILAR Journal. 40 (2), 51-58 (1999).
- Gibbs, D., Williams, D. S. Isolation and culture of primary mouse retinal pigmented epithelial cells. Advances in Experimental Medicine and Biology. 533, 347-352 (2003).
- Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. Isolation, culture, and characterization of primary mouse RPE cells. Nature Protocols. 11 (7), 1206-1218 (2016).
- Samra, Y. A., et al. Implication of N-Methyl-d-Aspartate receptor in homocysteine-induced age-related macular degeneration. International Journal of Molecular Sciences. 22 (17), 9356 (2021).
- van Marum, R. J. Update on the use of memantine in Alzheimer’s disease. Neuropsychiatric Disease and Treatment. 5, 237-247 (2009).
- Elsherbiny, N. M., et al. Homocysteine induces inflammation in retina and brain. Biomolecules. 10 (3), 393 (2020).
- Tawfik, A., Elsherbiny, N. M., Zaidi, Y., Rajpurohit, P. Homocysteine and age-related central nervous system diseases: role of inflammation. International Journal of Molecular Sciences. 22 (12), 6259 (2021).
- Shang, P., Stepicheva, N. A., Hose, S., Zigler Jr, J. S., Sinha, D. Primary cell cultures from the mouse retinal pigment epithelium. Journal of Visualized Experiments. (133), e56997 (2018).
- Chen, M., et al. Characterization of a spontaneous mouse retinal pigment epithelial cell line B6-RPE07. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 49 (8), 3699-3706 (2008).
- AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2020 Edition. Available from: https://www.avma.org/KB/Policies/Documents/euthanasia.pdf (2020)
- Cai, X., Conley, S. M., Naash, M. I. RPE65: role in the visual cycle, human retinal disease, and gene therapy. Ophthalmic Genetics. 30 (2), 57-62 (2009).
- Pérez-Álvarez, M. J., et al. Vimentin isoform expression in the human retina characterized with the monoclonal antibody 3CB2. Journal of Neuroscience Research. 86 (8), 1871-1883 (2008).
- Tawfik, A., Samra, Y. A., Elsherbiny, N. M., Al-Shabrawey, M. Implication of hyperhomocysteinemia in blood retinal barrier (BRB) dysfunction. Biomolecules. 10 (8), 1119 (2020).
- Promsote, W., Makala, L., Li, B., Smith, S. B., Singh, N., Ganapathy, V., Pace, B. S., Martin, P. Monomethylfumarate induces γ-globin expression and fetal hemoglobin production in cultured human retinal pigment epithelial (RPE) and erythroid cells, and in intact retina. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (8), 5382-5393 (2014).
