Billeddirigeret bioreaktor til generering af biomanirigeret luftvejsvæv
Summary
Protokollen beskriver en billeddannelsesaktiveret bioreaktor, der muliggør selektiv fjernelse af det endogene epitel fra rotteluftrøret og homogen fordeling af eksogene celler på lumenoverfladen efterfulgt af langvarig in vitro-kultur af cellevævskonstruktionen.
Abstract
Gentagen skade på luftvejsvæv kan forringe lungefunktionen og forårsage kronisk lungesygdom, såsom kronisk obstruktiv lungesygdom. Fremskridt inden for regenerativ medicin og bioreaktorteknologier giver mulighed for at producere laboratoriedyrkede funktionelle vævs- og organkonstruktioner, der kan bruges til at screene lægemidler, modellere sygdomme og konstruere vævsudskiftninger. Her beskrives en miniaturiseret bioreaktor kombineret med en billeddannelsesmodalitet, der muliggør in situ-visualisering af det indre lumen i eksplanteret rottetrachea under in vitro-vævsmanipulation og -kultur. Ved hjælp af denne bioreaktor demonstrerer protokollen billedstyret selektiv fjernelse af endogene cellulære komponenter, samtidig med at de iboende biokemiske egenskaber og ultrastruktur af luftvejsvævsmatrixen bevares. Desuden vises levering, ensartet fordeling og efterfølgende langvarig dyrkning af eksogene celler på det decellulariserede luftvejslumen med optisk overvågning in situ . Resultaterne fremhæver, at den billeddiagnostiske bioreaktor potentielt kan bruges til at lette dannelsen af funktionelle in vitro-luftvejsvæv .
Introduction
Den lysende overflade af luftvejene er foret med et lag af epitel, der hovedsageligt består af multicilierede, klub-, bæger- og basale stamceller 1,2. Epitellaget tjener som en primær forsvarsmekanisme i lungen, der fungerer som en biofysisk barriere, der beskytter det underliggende luftvejsvæv mod indåndede patogener, partikler eller kemiske gasser. Det beskytter luftvejsvævet via flere mekanismer, herunder intercellulær tæt krydsdannelse, mucociliær clearance og antimikrobiel og antioxidantsekretion 3,4. Det defekte luftvejsepitel er forbundet med ødelæggende luftvejssygdomme, såsom kronisk obstruktiv lungesygdom (KOL)5, primær ciliær dyskinesi (PCD)6 og cystisk fibrose (CF)7.
Fremskridt inden for lung-on-chip (LOC) teknologi repræsenterer en mulighed for at studere menneskelig lungeudvikling, modellere forskellige lungesygdomme og udvikle nye terapeutiske materialer i tæt regulerede in vitro-miljøer . For eksempel kan luftvejsepitel og endotel dyrkes på modsatte sider af en tynd, porøs membran for at efterligne gasudvekslingen af lungevæv, hvilket muliggør trofast sygdomsmodellering og lægemiddeltest8. Tilsvarende er der skabt in vitro-sygdomsmodeller til modellering af luftvejssygdomme in vitro, såsom KOL9 og cystisk fibrose10. En stor udfordring ved LOC-enheder er imidlertid at rekapitulere den komplekse tredimensionelle (3D) arkitektur i lungevævet og dynamiske celle-vævsmatrixinteraktioner in vitro11.
For nylig er der udviklet innovative vævstekniske metoder, der muliggør manipulation af ex vivo lungevæv12. Ved hjælp af disse metoder kan denuderede allogene eller xenogene vævstransplantater fremstilles ved at fjerne de endogene celler fra lungevævet via kemiske, fysiske og mekaniske behandlinger13. Derudover giver den bevarede indfødte vævs ekstracellulære matrix (ECM) i de decellulariserede lungestilladser de fysio-mimetiske strukturelle, biokemiske og biomekaniske signaler for implanterede celler til at vedhæfte, proliferere og differentiere14,15.
Her rapporteres et billeddiagnostisk styret bioreaktorsystem skabt ved at kombinere LOC og vævstekniske teknologier for at muliggøre in vitro-vævsmanipulation og dyrkning af udplantet rottetrachealvæv. Ved hjælp af denne luftvejsvævsbioreaktor demonstrerer protokollen selektiv fjernelse af de endogene epitelceller uden at forstyrre de underliggende subepitelcellulære og biokemiske komponenter i luftvejsvævet. Vi viser derefter den homogene fordeling og øjeblikkelige aflejring af de nyligt såede eksogene celler, såsom mesenkymale stamceller (MSC’er), på det denuderede luftvejslumen ved at indgyde det cellebelastede kollagen I pre-gel-opløsning. Derudover udføres visualiseringen af luftrørets lumen under epitelfjernelse og endogen cellelevering ved hjælp af den mikrooptiske billeddannelsesenhed, der er integreret i bioreaktoren. Endvidere er det vist, at luftrøret og nyligt implanterede celler kan dyrkes i bioreaktoren uden mærkbar celledød og vævsnedbrydning i 4 dage. Vi forestiller os, at den billeddannende bioreaktorplatform, den tyndfilmsbaserede de-epithelialiseringsteknik og celleleveringsmetoden, der anvendes i denne undersøgelse, kan være nyttige til generering af luftvejsvæv til di vitro-sygdomsmodellering og lægemiddelscreening.
Bioreaktoren omfatter et rektangulært kammer forbundet til en programmerbar sprøjtepumpe, perfusionspumpe og ventilator til dyrkning af isoleret rottetrachea. Bioreaktoren har indløb og udløb, der er forbundet med luftrøret eller vævskulturkammeret for separat at levere reagenser (f.eks. Kulturmedier) til luftrørets indre og ydre rum (figur 1). Et specialbygget billeddannelsessystem kan bruges til at visualisere det indre af den in vitro-dyrkede rottetrachea på celleniveau (figur 2). Luftrørets endogene epitel fjernes via indånding af en vaskemiddelbaseret decellulariseringsopløsning efterfulgt af vibrationsassisteret luftvejsvask (figur 3). Hydrogelopløsning, såsom type I-kollagen, anvendes som et leveringsmiddel til såning af eksogene celler ensartet og øjeblikkeligt over det denuderede luftrørslumen (figur 4). Alle de materialer, der bruges til at konstruere bioreaktoren og udføre eksperimenterne, findes i materialetabellen.
Protocol
Representative Results
Discussion
I dette arbejde skabte vi en billeddiagnostisk guidet bioreaktor, der kan muliggøre (i) overvågning af luftrøret lumen in situ efter cellefjernelse og eksogen cellelevering og (ii) langsigtet in vitro-kultur af det cellefrøede luftrørsvæv. Ved hjælp af denne specialbyggede bioreaktor demonstrerede vi (i) selektiv fjernelse af de endogene epitelceller fra luftrørets lumen ved hjælp af vaskemiddel og vibrationsassisteret luftvejsvask og (ii) ensartet fordeling af eksogene celler på luminaloverfl…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne forskning er delvist støttet af American Thoracic Society Foundation Research Program, New Jersey Health Foundation og National Science Foundation (CAREER Award 2143620) til J.K.; og National Institutes of Health (P41 EB027062) til G.V.N.
Materials
| 1× PBS | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 10-010-031 | |
| 3-port connector | World Precision Instruments | 14048-20 | |
| 4-port connector | World Precision Instruments | 14047-10 | |
| Accelerometer | STMicroelectronics | IIS3DWBTR | |
| Achromatic doublet | Thorlabs | AC254-150-A-ML | |
| Aluminum pin stub | TED PELLA | 16111 | |
| Antibiotic-antimycotic | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | |
| Assembly rod | Thorlabs | ER1 | |
| Button head screws | McMaster-Carr | 91255A274 | |
| Cage cube | Thorlabs | C4W | |
| Carbon double-sided conductive tape | TED PELLA | 16073 | |
| CFSE labelling kit | Abcam | ab113853 | |
| Citrisolv (clearing agent) | Decon | 1061 | |
| C-mount adapter | Thorlabs | SM1A9 | |
| Collagen I | Advanced BioMatrix | 5153 | |
| Conductive liquid silver paint | TED PELLA | 16034 | |
| Dichroic mirror | Semrock | DI03-R488 | Reflected laser wavelengths: 473.0 +- 2 nm 488.0 +3/-2 nm |
| Dulbecco's modified Eagle’s medium | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 11965118 | |
| Female luer bulkhead to hose barb adapter | Cole-Parmer | EW-45501-30 | |
| Female luer to tubing barb | Cole-Parmer | EW-45508-03 | |
| Female to male luer connector | Cole-Parmer | ZY-45508-80 | |
| Fetal bovine serum | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 10082147 | |
| Filter lens | Chroma Technology Corp | ET535/50m | |
| Fluorescent microscope | Nikon | Eclipse E1000 – D | |
| Fusion 360 | Autodesk | ||
| Hex nut | McMaster-Carr | 91813A160 | |
| Hexamethyldisilazane (HMDS) | Fisher Scientifc | AC120585000 | |
| Imaging fiber | SELFOC, NSG group | GRIN lens | |
| Laser | Opto Engine | MDL-D-488-150mW | |
| Lens tubes | Thorlabs | SM1L40 | |
| LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit (Invitrogen) | Thermo Fisher Scientific | L3224 | |
| MACH 3 CNC Control Software | Newfangled Solutions | ||
| Objective lens | Olympus | UCPLFLN20X | |
| Peristaltic Pump | Cole Parmer | L/S standard digital pump system | |
| Recombinant human FGF-basic | PeproTech | 100-18B | |
| Retaining ring | Thorlabs | SM1RR | |
| Scientific CMOS camera | PCO Panda | PCO Panda 4.2 | |
| Sodium dodecyl sulfate | VWR | 97064-472 | |
| Solidworks (2019) | Dassault Systèmes | ||
| Stackable lens tube | Thorlabs | SM1L10 | |
| Subwoofer plate amplifier | Dayton Audio | SPA250DSP | |
| Subwoofer speaker | Dayton Audio | RSS21OHO-4 | Diaphragm diameter: 21 cm |
| Syringe Pump | World Precision Instruments | AL-4000 | |
| Threaded cage plate | Thorlabs | CP33 | |
| Threaded luer adapter | Cole-Parmer | EW-45513-81 | |
| Tube lens | Thorlabs | AC254-150-A-ML | |
| Tygon Tubing | Cole-Parmer | 13-200-110 | |
| XY Translator | Thorlabs | CXY1 |
Riferimenti
- Rackley, C. R., Stripp, B. R. Building and maintaining the epithelium of the lung. The Journal of Clinical Investigation. 122 (8), 2724-2730 (2012).
- Rayner, R. E., Makena, P., Prasad, G. L., Cormet-Boyaka, E. Optimization of Normal Human Bronchial Epithelial (NHBE) cell 3D cultures for in vitro lung model studies. Scientific Reports. 9 (1), 500 (2019).
- Gohy, S., Hupin, C., Ladjemi, M. Z., Hox, V., Pilette, C. Key role of the epithelium in chronic upper airways diseases. Clinical and Experimental Allergy. 50 (2), 135-146 (2020).
- Ganesan, S., Comstock, A. T., Sajjan, U. S. Barrier function of airway tract epithelium. Tissue Barriers. 1 (4), 24997 (2013).
- De Rose, V., Molloy, K., Gohy, S., Pilette, C., Greene, C. M. Airway epithelium dysfunction in cystic fibrosis and COPD. Mediators of Inflammation. 2018, 1309746 (2018).
- Horani, A., Ferkol, T. W. Advances in the genetics of primary ciliary dyskinesia: Clinical implications. Chest. 154 (3), 645-652 (2018).
- Berical, A., Lee, R. E., Randell, S. H., Hawkins, F. Challenges facing airway epithelial cell-based therapy for cystic fibrosis. Frontiers in Pharmacology. 10, 74 (2019).
- Shrestha, J., et al. Lung-on-a-chip: the future of respiratory disease models and pharmacological studies. Critical Reviews in Biotechnology. 40 (2), 213-230 (2020).
- Benam, K. H., et al. Small airway-on-a-chip enables analysis of human lung inflammation and drug responses in vitro. Nature Methods. 13 (2), 151-157 (2016).
- Plebani, R., et al. Modeling pulmonary cystic fibrosis in a human lung airway-on-a-chip. Journal of Cystic Fibrosis. , (2021).
- Griffith, L. G., Swartz, M. A. Capturing complex 3D tissue physiology in vitro. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (3), 211-224 (2006).
- Gilpin, S. E., Wagner, D. E. Acellular human lung scaffolds to model lung disease and tissue regeneration. European Respiratory Review. 27 (148), 180021 (2018).
- Badylak, S. F., Taylor, D., Uygun, K. Whole-organ tissue engineering: decellularization and recellularization of three-dimensional matrix scaffolds. Annual Review of Biomedical Engineering. 13, 27-53 (2011).
- Gilpin, S. E., Charest, J. M., Ren, X., Ott, H. C. Bioengineering lungs for transplantation. Thoracic Surgery Clinics. 26 (2), 163-171 (2016).
- Calle, E. A., Leiby, K. L., Raredon, M. B., Niklason, L. E. Lung regeneration: steps toward clinical implementation and use. Current Opinion in Anaesthesiology. 30 (1), 23-29 (2017).
- Planchard, D. . Engineering Design with SOLIDWORKS 2022: A Step-by-Step Project Based Approach Utilizing 3D Solid Modeling. , (2022).
- Coward, C. . A Beginner’s Guide to 3D Modeling: A Guide to Autodesk Fusion 360. , (2019).
- Meza, G., Carpio, C. D., Vinces, N., Klusmann, M. . 2018 IEEE XXV International Conference on Electronics, Electrical Engineering and Computing (INTERCON. , 1-4 (2018).
- Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
- Tchoukalova, Y. D., Hintze, J. M., Hayden, R. E., Lott, D. G. Tracheal decellularization using a combination of chemical, physical and bioreactor methods. The International Journal of Artificial Organs. 41 (2), 100-107 (2017).
- Partington, L., et al. Biochemical changes caused by decellularization may compromise mechanical integrity of tracheal scaffolds. Acta Biomaterialia. 9 (2), 5251-5261 (2013).
- Balestrini, J. L., et al. Production of decellularized porcine lung scaffolds for use in tissue engineering. Integrative Biology. 7 (12), 1598-1610 (2015).
- Taylor, D. A., Sampaio, L. C., Ferdous, Z., Gobin, A. S., Taite, L. J. Decellularized matrices in regenerative medicine. Acta Biomaterialia. 74, 74-89 (2018).
- Huang, S. X., et al. Efficient generation of lung and airway epithelial cells from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 32 (1), 84-91 (2014).
- Huang, S. X. L., et al. The in vitro generation of lung and airway progenitor cells from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 10 (3), 413-425 (2015).
- Kim, J., O’Neill, J. D., Dorrello, N. V., Bacchetta, M., Vunjak-Novakovic, G. Targeted delivery of liquid microvolumes into the lung. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (37), 11530-11535 (2015).
- Kim, J., O’Neill, J. D., Vunjak-Novakovic, G. Rapid retraction of microvolume aqueous plugs traveling in a wettable capillary. Applied Physics Letters. 107 (14), 144101 (2015).
- O’Neill, J. D., et al. Decellularization of human and porcine lung tissues for pulmonary tissue engineering. The Annals of Thoracic Surgery. 96 (3), 1046-1056 (2013).
- Sengyoku, H., et al. Sodium hydroxide based non-detergent decellularizing solution for rat lung. Organogenesis. 14 (2), 94-106 (2018).
- Walters, M. S., et al. Generation of a human airway epithelium derived basal cell line with multipotent differentiation capacity. Respiratory Research. 14 (1), 135 (2013).
- O’Neill, J. D., et al. Cross-circulation for extracorporeal support and recovery of the lung. Nature Biomedical Engineering. 1 (3), 0037 (2017).
- Guenthart, B. A., et al. Regeneration of severely damaged lungs using an interventional cross-circulation platform. Nature Communications. 10 (1), 1985 (2019).
- Chen, J., et al. Non-destructive vacuum-assisted measurement of lung elastic modulus. Acta Biomaterialia. 131, 370-380 (2021).
- Dorrello, N. V., et al. Functional vascularized lung grafts for lung bioengineering. Science Advances. 3 (8), 1700521 (2017).
