Kometanalysen er et populært middel til at opdage DNA-skader. Denne undersøgelse beskriver en tilgang til at køre dias i repræsentative varianter af kometanalysen. Denne tilgang øgede antallet af prøver betydeligt, samtidig med at analysens driftstid blev reduceret, antallet af glidemanipulationer og risikoen for skade på geler.
Celler udsættes løbende for stoffer, der stammer fra de interne og eksterne miljøer, hvilket kan skade DNA. Denne skade kan forårsage afvigende cellefunktion, og derfor kan DNA-skader spille en kritisk rolle i udviklingen af alle større menneskelige sygdomme, f.eks. kræft, neurodegenerative og hjerte-kar-sygdomme og aldring. Enkeltcellet gelelektroforese (dvs. kometassayet) er en af de mest almindelige og følsomme metoder til at studere dannelsen og reparationen af en lang række typer DNA-skader (f.eks. Enkelt- og dobbeltstrengsbrud, alkali-labile steder, DNA-DNA-tværbindinger og i kombination med visse reparationsenzymer oxiderede puriner og pyrimidiner) både in vitro og in vivo . Systemer. Imidlertid er den lave prøvegennemstrømning af det konventionelle assay og besværlige prøveoparbejdning begrænsende faktorer for dens bredest mulige anvendelse. Med “scoring” af kometer i stigende grad automatiseret, er begrænsningen nu evnen til at behandle et betydeligt antal kometdias. Her er der udviklet en high-throughput (HTP) variant af kometassay (HTP comet assay), som signifikant øger antallet af analyserede prøver, reducerer analysens køretid, antallet af individuelle diasmanipulationer, reagenskrav og risiko for fysisk skade på gelerne. Desuden reduceres elektroforesetankens fodaftryk betydeligt på grund af glidernes lodrette orientering og integreret afkøling. Også rapporteret her er en ny tilgang til chilling komet assay dias, som bekvemt og effektivt letter størkningen af kometgelerne. Her er anvendelsen af disse enheder til repræsentative kometanalysemetoder blevet beskrevet. Disse enkle innovationer understøtter i høj grad brugen af kometanalysen og dens anvendelse på undersøgelsesområder såsom eksponeringsbiologi, økotoksikologi, bioovervågning, toksicitetsscreening/-test sammen med forståelse af patogenese.
Celler udsættes løbende for stoffer, der stammer fra de interne og eksterne miljøer, hvilket kan skade DNA 1,2. Denne skade kan forårsage afvigende cellefunktion3, og derfor kan DNA-skader spille en kritisk rolle i udviklingen af mange større menneskelige sygdomme, fx kræft, neurodegenerativ og hjerte-kar-sygdom og aldring4. Kometanalysen (også kaldet enkeltcellet gelelektroforese) er en stadig mere populær metode til påvisning og kvantificering af cellulær DNA-skade.
På sit enkleste registrerer det alkaliske kometassay (ACA) strengbrud (SB; både enkelt og dobbelt) sammen med apuriniske / apyrimidiniske steder og alkali-labile steder (ALS), som begge bliver enkeltstrengede brud under alkaliske forhold5. Det neutrale pH-kometassay kan evaluere ærlige enkelt- og dobbeltstrengede brud6. Desuden kan ACA i kombination med en række DNA-reparationsenzymer detektere en betydelig række typer DNA-skader, f.eks. oxiderede puriner (identificeret ved anvendelse af human 8-oxoguanin DNA-glycosylase 1; hOGG17); oxiderede pyrimidiner (ved anvendelse af Endonuklease III; EndoIII) og cyclobutanpyrimidindimerer (ved anvendelse af T4-endonuklease V; T4endoV)8. Kometanalysen kan også bruges til at evaluere DNA-læsioner induceret af tværbindingsmidler, såsom cisplatin 9,10,11. Som det fremgår af analysens formelle navn, dvs. enkeltcellegelelektroforese, er analysen afhængig af, at de celler, der analyseres, er en enkeltcellesuspension; Oftest er disse dyrkede celler, men kan isoleres fra fuldblod 12,13, eller fuldblod selv kan bruges 14,15. Alternativt kan en enkeltcellesuspension genereres fra fast væv.
Bortset fra nogle få undtagelser, især CometChip-rapporterne fra Engleward-laboratoriet 16, har den overordnede kometassayprotokol ikke ændret sig dramatisk fra den, der oprindeligt blev beskrevet af assayets opfindere (Östling og Johansson17 og Singh etal.18). Kometanalysen involverer adskillige trin (figur 1). Mange af disse trin involverer overførsel af de tynde, celleholdige agarosegeler, et dias ad gangen, og udgør derfor en risiko for skade eller tab af gelen, hvilket bringer eksperimentets succes i fare. Derfor kan kometanalysen være tidskrævende, især hvis der køres et betydeligt antal dias. Typisk køres maksimalt 40 dias i en stor (33 cm x 59 cm x 9 cm) elektroforesetank, som sidder i en endnu større bakke indeholdende våd is til afkøling. Det er for nylig blevet rapporteret, at analysens driftstid kan forkortes til 1 dag ved at reducere varigheden af lysistrinnet og ikke tørre diasene før farvning19.
De nuværende forfattere har tidligere rapporteret om en ny tilgang til high throughput alkaline comet assay (HTP ACA), hvor flere (batches af 25) kometassay mikroskop dias kan manipuleres samtidigt i hele kometassayprocessen20,21,22. Denne patenterede tilgang minimerer risikoen for skade på eller tab af de prøveholdige geler ved at fjerne behovet for at manipulere mikroskopglassene individuelt og kan anvendes på alle varianter af kometassayet, der bruger mikroskopdias. De diasholdige stativer beskytter gelerne under manipulationerne, og derfor er prøvebehandlingen hurtigere og mere effektiv. Diasene kan også gennemgå elektroforese i stativerne, holdt i lodret snarere end vandret orientering. Dette og integreret afkøling reducerer elektroforesetankens fodaftryk betydeligt og fjerner behovet for våd is. Samlet set udgør dette en betydelig forbedring i forhold til den konventionelle procedure. Det anvendte udstyr er illustreret i figur 2. De her beskrevne protokoller viser ved hjælp af denne nye tilgang den repræsentative anvendelse på dyrkede celler og fuldblod14 til påvisning af alkali-labile steder (ALS), DNA-inter-strengs tværbindinger (ICL) og substraterne af forskellige DNA-reparationsenzymer.
Denne undersøgelse viser alsidigheden fra det nuværende udstyr, som kan bruges til at opnå høj gennemstrømning med en række repræsentative, almindelige varianter af kometanalysen (dvs. alkalisk, enzymmodificeret, blod og ICL, og andre varianter vil også være egnede). Desuden medfører den nuværende tilgang flere fordele 20,21: a) analysens driftstid reduceres på grund af manipulation af flere dias parallelt (håndteringstiden falder med60 %); b) risikoen for beskadigelse af geler og dermed risikoen for forsøget mindskes c) reagenskravene er nedsat (f.eks. er elektroforesetankens volumen mindre end den konventionelle tank) d) antallet af kørsler øges. En tank kan give en 20% stigning i antallet af dias, der køres sammenlignet med en enkelt konventionel tank; Imidlertid kan flere elektroforesetanke køres eller slaves (dvs. flere tanke styret af en enkelt strømforsyning) parallelt fra den samme strømforsyning og kræver stadig et bordfodaftryk, der er mindre end en enkelt konventionel tank med isbakke; og (e) tankens fodaftryk reduceres på grund af lodret orientering af dias og integreret køling (sparer laboratorieplads); HTP-tanken består af en højtydende keramisk kølebase med en glidende skuffe, der kan passe til en frossen kølepakke for at opretholde optimal buffertemperatur uden at skulle udføre processen i et koldt rum.
Desuden rummer den køleplade, vi har udviklet, 26 kometrutsjebaner, muliggør hurtig størkning af det lave smeltepunkt agarose på kometassay-diasene og letter en let hentning af diasene, efter at agarosegelen er størknet. Ovenstående innovationer gør kometanalyseprocessen enklere og lettere.
Mens der er udviklet andre tilgange med høj kapacitet (f.eks. 12-gel kometassay, CometChip eller 96 mini-gelformater)25, foretrækker mange forskere at bruge de konventionelle mikroskopdias (som inkluderer de kommercielt tilgængelige præ-coatede dias eller andre specialiserede dias). Den nuværende tilgang kan rumme alle typer mikroskopdias, hvilket gør det muligt at skalere eksperimenter, der bruger disse dias, op gennem hurtigere diasbehandling og håndtering. Som nævnt ovenfor giver HTP-kometsystemet mange fordele, men der er en bemærkelsesværdig begrænsning: Den nuværende tilgang giver kun en stigning på 20% i antallet af prøver, der køres, sammenlignet med en konventionel vandret tank (selvom behandling af dias er meget hurtigere). CometChip og 96 mini-gel formater kører et større antal prøver. Til dato ved vi ikke, om den nuværende tilgang kan rumme CometChip- eller 96 mini-gel-formaterne, selvom vi forudsiger, at det vil. Som nævnt ovenfor kan antallet af prøver øges yderligere ved at slavebinde tanke til en enkelt strømforsyning. Som med alle tilgange er der stadig en chance for at miste eller beskadige gelerne, mens de indlæser prøver og analyserer dem under mikroskopet, men det skyldes mere operatørfejl, og chancerne for dette minimeres med den nuværende tilgang.
Brugen af HTP komet system kan i høj grad hjælpe med at analysere DNA-skader, lette brugen af komet assay i en bred vifte af applikationer, såsom molekylær epidemiologi, mandlig reproduktiv videnskab, genotoksikologi undersøgelser, og miljøtoksikologi. Dette gælder især for de brugere, der ønsker at have alle fordelene ved forbedret gennemstrømning og brugervenlighed uden at bevæge sig væk fra de velkendte, omkostningseffektive, konventionelle mikroskopdias.
The authors have nothing to disclose.
Det arbejde, der er rapporteret i denne publikation, blev delvist støttet af National Institute of Environmental Health Sciences fra National Institutes of Health under tildelingsnummer: 1R41ES030274. Indholdet er udelukkende forfatternes ansvar og repræsenterer ikke nødvendigvis den officielle opfattelse af National Institutes of Health.
22 x 22 mm glass coverslips | Fisher Scientific, Hampton, NH, USA | 631-0124 | |
A2780 | ECACC, Louis, MO, USA |
93112519 | |
Concentrated nitric acid (OptimaTM grade) | Fisher Scientific Fair Lawn, NJ, USA | A467-250 | |
Fluorescence microscope equipped with a camera | Zeiss, Jena, Germany | ||
Fresh human whole blood | Zen Bio Inc | SER-WB10ML | Commercial human whole blood sample |
GraphPad Prism | GraphPad Software, San Diego, California | Data analysis software | |
HTP Comet Assay system | Cleaver Scientific | COMPAC- 50 | |
Human Keratinocyte (HaCaTs) | American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA, USA | Discontinued | Can be purchased from another company ADDEXBIO TECHNOLOGIES Cat# T0020001 |
Hydrogen peroxide (H2O2) 30% in water |
Fisher Scientific, Hampton, NH, USA | BP2633-500 | |
ICP-MS iCAP RQ ICP-MS system |
Thermo Scientific, Waltham, MA, USA |
IQLAAGGAAQFAQKMBIT | |
Image and Data Analysis software | Perceptive Instrument, Bury St Edmunds, England, UK |
125525 | Free image analysis softwared is available e.g., ImageJ |
Internal Standard Mix | SPEX Certiprep, Metuchen, NJ, USA |
CL-ISM1-500 | Bismuch (isotope monitored 209 Bi)-concnetration of 10 µg/mL in 5% HNO3 |
Low melting point Agarose | Invitrogen Waltham, MA, USA |
P4864 | |
Na2EDTA (disodium ethylenediaminetetraacetic acid) | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA |
E5134 | |
NaCl (Sodium chloride) | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA |
S7653 | |
NanoDrop One | Thermo Scientific, Waltham, MA, USA |
701-058108 | Nanodrop for measuring DNA concentration |
Nanopure Infinity Ultrapure Water System (Barnstead Nanopure) | Thermo Scientific, Waltham, MA, USA |
D11901 | Ultrapure water (16 MΩ cm-1) |
NaOH (sodium Hydroxide) | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA |
E5134 | |
Normal melting point Agarose | Fisher Scientific, Hampton, NH, USA |
16520100 | For pre-coating slides |
OCI-P5X | University of Miami, Miami, FL, USA |
N/A | Live Tumor Culture Core facility provided the cells |
Platinum (Pt) reference standard | SPEX Certiprep, Metuchen, NJ, USA |
PLPT3-2Y | (1000 µg/mL in 10% HCl) containing Bismuch |
Propidium Iodide (1.0 mg/mL in water) |
Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA |
12-541BP486410ML | |
QIAamp DNA Mini Kit | Qiagen Valencia, CA, USA |
51304 | DNA extraction Kit |
Single-frosted glass microscope slides | Fisher Scientific, Hampton, NH, USA |
12-541B | |
SKOV3 | ECACC, Louis, MO, USA |
91091004 | |
Slide box | Fisher Scientific, Hampton, NH, USA |
03-448-2 | Light proof, to protect cells from the formation adventitious damage (according to the widely held view) and prevent fading of the fluorescent dye |
Slide Chilling plate | Cleaver Scientific, Rugby, England, UK |
CSL-CHILLPLATE | |
Treatment dish | Cleaver Scientific, Rugby, England, UK |
STAINDISH4X | |
Tris-base | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA |
93362 | |
Triton X-100 | Fisher Scientific, Hampton, NH, USA |
BP151-500 | |
Trypsin EDTA (0.5%) | Invitrogen Gibco, Waltham, MA, USA |
15400054 | |
Vertical Slide Carrier | Cleaver Scientific, Rugby, England, UK |
COMPAC-25 |