Denne protokol beskriver en iSCAT-baseret billedbehandlings- og enkeltpartikelsporingsmetode, der muliggør samtidig undersøgelse af molekylmassen og den diffusive opførsel af makromolekyler, der interagerer med lipidmembraner. Trinvise instruktioner til prøveforberedelse, masse-til-kontrast-konvertering, filmopkøb og efterbehandling gives sammen med anvisninger for at forhindre potentielle faldgruber.
Kortvarige eller forbigående interaktioner mellem makromolekyler ved og med lipidmembraner, en grænseflade, hvor en lang række væsentlige biologiske reaktioner finder sted, er i sagens natur vanskelige at vurdere med standard biofysiske metoder. Indførelsen af massefølsom partikelsporing (MSPT) udgør et vigtigt skridt i retning af en grundig kvantitativ karakterisering af sådanne processer. Teknisk set blev dette gjort muligt gennem fremkomsten af interferometrisk spredningsmikroskopi (iSCAT)-baseret massefotometri (MP). Når baggrundsfjernelsesstrategien er optimeret til at afsløre den todimensionelle bevægelse af membranassocierede partikler, tillader denne teknik realtidsanalyse af både diffusion og molekylmasse af umærkede makromolekyler på biologiske membraner. Her beskrives en detaljeret protokol til udførelse og analyse af massefølsom partikelsporing af membranassocierede systemer. Målinger udført på et kommercielt massefotometer opnår tidsopløsning i millisekundregimet og, afhængigt af MP-systemet, en massedetektionsgrænse ned til 50 kDa. For at vise MSPT’s potentiale til den dybtgående analyse af membrankatalyseret makromolekyledynamik generelt præsenteres resultater opnået for eksemplariske proteinsystemer såsom den oprindelige membrankonaktator annexin V.
Engang blot opfattet som en barriere mod den brede vifte af omgivende fysiske forhold, betragtes biologiske membraner i dag som funktionelle enheder og katalytiske platforme 1,2. Baseret på deres evne til at lokalisere, forstærke og dirigere signaler som reaktion på membranassocierede makromolekylereaktioner udgør lipidgrænseflader et afgørende element for en lang række cellulære processer såsom membranhandel og signalkaskader 3,4,5. Membranfastgørelse, der tjener som et nukleationssted til samling af stabile komplekser, er ofte afhængig af en dynamisk ligevægt mellem membranassocierede og cytosoliske former for makromolekyler og er derfor af forbigående karakter 6,7.
På trods af deres store betydning i biologi har det hidtil været udfordrende at udvikle metoder, der kan give adgang til de kompositoriske, rumlige og tidsmæssige heterogeniteter af membranassocierede makromolekylereaktioner i realtid 7,8. For at løse de underliggende molekylære processer er to eksperimentelle aspekter afgørende: tilstrækkelig tidsopløsning og enkeltpartikelfølsomhed. Derfor har ensemble gennemsnitlige teknikker såsom fluorescensgendannelse efter fotoblegning (FRAP), men også den meget mere følsomme fluorescenskorrelationsspektroskopi (FCS) begrænsninger, da de stort set afkobler rumlig information fra tidsmæssig information9. Et vigtigt skridt i retning af karakteriseringen af individuel molekyledynamik har således været fremkomsten af enkeltpartikelsporing (SPT) i kombination med meget følsom mikroskopi. Navnlig har to SPT-tilgange vist sig at være effektive i denne henseende. For det første banede brugen af fluoroforer som etiketter og de tilsvarende fluorescensdetekteringssystemer vejen for nanometerpræcision og millisekundtidsopløsning 10,11,12. For det andet forbedrede spredningsbaseret detektion ved hjælp af guldnanopartikler både lokaliseringspræcision og tidsopløsning til henholdsvis sub-nanometer- og mikrosekundområdet, henholdsvis 13,14,15,16. På trods af de mange fordele ved begge tilgange og deres betydelige bidrag vedrørende den mekanistiske forståelse af membranassocierede systemer 17,18 har begge teknikker hidtil været begrænsede: de kræver mærkning af de molekyler af interesse, som potentielt forstyrrer deres oprindelige adfærd og er ufølsomme over for den molekylære sammensætning af membranassocierede partikler 19,20.
Begge disse begrænsninger er for nylig blevet overvundet ved indførelsen af en ny interferometrisk spredning (iSCAT)-baseret tilgang nævnt massefotometri (MP)21,22,23. Denne teknik gør det muligt at bestemme massefordelinger i opløsningen af biomolekyler i henhold til deres iSCAT-kontrast, når de lander på en glasgrænseflade. Til påvisning og karakterisering af mobile molekyler, der diffunderer på lipidmembraner, måtte der imidlertid udvikles en mere sofistikeret billedanalysemetode. Dette er i mellemtiden blevet implementeret med succes og gør det muligt at detektere, spore og bestemme molekylmassen af enkelte umærkede biomolekyler, der diffunderer på en lipidgrænseflade24,25. Denne teknik, der kaldes dynamisk massefotometri eller massefølsom partikelsporing (MSPT), muliggør nu vurdering af komplekse makromolekyleinteraktioner ved direkte at registrere ændringer i molekylmassen af de sporede enheder og åbner dermed nye muligheder for mekanistisk analyse af membranassocieret molekylær dynamik.
Her præsenteres en detaljeret protokol til prøveforberedelse, billeddannelse og den dataanalysepipeline, der kræves til MSPT. Navnlig diskuteres prøvekrav og potentielle problemer, der kan opstå under måling og analyse. Desuden fremvises det uovertrufne potentiale til at analysere membran-interagerende makromolekylesystemer gennem forskellige repræsentative resultater.
Den præsenterede protokol udvider massefotometri21, en teknik, der analyserer massen af enkelte biomolekyler, der adsorberer på glas, til et endnu mere alsidigt værktøj, der er i stand til samtidig at måle massen og diffusionen af umærkede membran-interagerende biomolekyler. Denne analyseudvidelse opnås gennem implementering af en modificeret baggrundsfjernelsesstrategi tilpasset den laterale bevægelse af molekyler24,25. Generelt er fjernelsen af baggrunden af største betydning for iSCAT-baserede tilgange, da den stærke spredning af glasoverfladens ruhed udgør den vigtigste analysehindring, og den nøjagtige bestemmelse af hver pixels lokale baggrund er afgørende for kvantificering af partikelmasse og placering. Udover billedanalysen, der er tilpasset partikelbevægelse, fuldender efterfølgende partikeldetektion, baneforbindelse og dataanalyse den nye udvidelse af MP til massefølsom partikelsporing (MSPT).
Generelt er grundigt rengjorte glasafdækningsrutsjebaner og et rent arbejdsmiljø kritiske krav til en vellykket udførelse af MSPT-eksperimenter. På grund af fraværet af makromolekylemærkning er det erhvervede signal i sagens natur ikke-selektivt. Rene prøver samt korrekt prøvehåndtering er derfor afgørende for at sikre, at observationer ikke kan misfortolkes. Især når molekyler med lav molekylvægt undersøges, godkendes kontrolmålinger af proteinfrie membraner for at vurdere baggrundsbidrag (supplerende figur 1). Ud over medtagelsen af kontrolmålinger anbefales det derfor at følge forberedelsestrinnene i figur 2 for hvert flowkammer. Når de kombineres, vil disse sikkerhedsforanstaltninger sikre, at det detekterede signal stammer fra det biomolekyle, der er af interesse, og ikke for eksempel et forurenet flowkammer, buffer eller membran.
Udover forholdsreglerne vedrørende det eksperimentelle design skal der også tages omhu under MSPT-billedbehandling. Under videobehandlingen bør værdien for tre parametre vælges omhyggeligt for at sikre korrekte resultater: i) længden af medianvinduet til fjernelse af baggrunden, ii) tærsklen for partikeldetektion og iii) den maksimale søgeradius under sammenkædningsopgaven. Et større medianvindue (i) letter generelt adskillelsen af diffuserende partikler fra den overlejrede kvasikonstante baggrund. For store vinduesstørrelser vil prøveafdrift dog i sidste ende blive mærkbar og mindske nøjagtigheden af baggrundsestimeringen. Optimale indstillinger afhænger i høj grad af prøveegenskaber og måleforhold. Ikke desto mindre kan en værdi på 1.001 bruges som et robust udgangspunkt. Tærskelparameteren (ii) skal indstilles afhængigt af den laveste molekylmasse, der forventes i prøven. En værdi under 0,0005 anbefales ikke til målinger taget med det massefotometer, der anvendes i denne undersøgelse. For at fremskynde analysetiderne kan der vælges højere værdier, hvis der forventes en prøve med høj molekylvægt. Søgeradius i banesammenkædning (iii) angiver den maksimale radiale afstand i pixels, hvor partiklens forskudte placering vil blive søgt efter i på hinanden følgende rammer. Det skal tilpasses den hurtigste partikel i prøven, og hvis det foretrækkes, kan et adaptivt søgeområde (se dokumentation af trackpy) i stedet bruges til at reducere beregningstiden. Især i den indledende fase af et projekt anbefales det at genanalysere filmene med forskellige parametre for at validere de opnåede resultater.
I lyset af MSPT’s enkeltmolekylekarakter bør det undgås at måle ved høje membranpartikeltætheder, da disse kan forstyrre nøjagtig kontrast og massebestemmelse. Det har vist sig, at tætheder under en partikel pr. Kvadratisk mikrometer er gunstige for MSPT-målinger24. En yderligere overvejelse er de forventede diffusionskoefficienter i prøven. Selv om MSPT finder anvendelse på en bred vifte af diffusionskoefficienter, har MSPT en nedre grænse for tilgængelige diffusionskoefficienter. Lokal indespærring i et område på få pixels i en betydelig del af medianvinduesperioden fusionerer partiklen med den statiske baggrund. For de billeddannelsesbetingelser, der anvendes i denne protokol, anbefales det ikke at måle diffusionskoefficienter under 0,01 μm2/s. Ved denne diffusionshastighed er for eksempel den gennemsnitlige kvadrerede forskydning af en partikel under medianvinduets halvstørrelse ca. 4 pixels og dermed af samme størrelse som PSF’s udstrækning. Som følge heraf vil det statiske baggrundsestimat sandsynligvis indeholde signalbidrag fra selve partiklen, hvilket resulterer i en tilsyneladende reduceret kontrast af partiklen, indtil den til sidst nærmer sig støjniveauet. Makromolekylediffusionskoefficienter på mellem 0,05 og 10 μm2/s kan dog klart løses.
For yderligere at udvide rækkevidden af MSPT-applikationer kan man forestille sig en udvikling af den medianbaserede baggrundsalgoritme gennem eliminering af pixels, der midlertidigt er optaget af en partikel, eller ved prøveafdriftkorrektion, der muliggør større medianvinduesstørrelser. Begge tilgange ville afhjælpe problemerne med målinger ved høje partikeltætheder og langsom diffusion. Forbedringer med hensyn til lavere massefølsomhed er på vej med en ny generation af massefotometre, som kan give adgang til biomolekyler mindre end 50 kDa. Derfor vil fremtidige MSPT-eksperimenter være i stand til at studere enkeltmolekyledynamik og membranrelaterede interaktioner for et endnu bredere udvalg af membranefterligninger såsom polstrede dobbeltlag og makromolekylære systemer.
The authors have nothing to disclose.
Vi sætter stor pris på støtten fra Philipp Kukura, Gavin Young og Refeyn-softwareteamet og anerkender deres hjælp ved at dele dele af billedanalysekoden. Vi takker Cryo-EM MPIB Core Facility for at give adgang til det kommercielle Refeyn massefotometer. F.S. anerkender taknemmeligt den støtte og finansiering, som Jürgen Plitzko og Wolfgang Baumeister har ydet. T.H. og P.S. modtog støtte gennem Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, German Research Foundation) – Project-ID 201269156 – SFB 1032 (A09). N.H. blev støttet af et DFG-returtilskud HU 2462/3-1. P.S. anerkender støtte gennem forskningsnetværket MaxSynBio via det fælles finansieringsinitiativ fra det tyske forbundsministerium for uddannelse og forskning (BMBF) og Max Planck Society.
annexin V | Sigma Aldrich | #SRP8026 | examplary membrane-interacting protein |
Bio-Rad Protein Assay | Bio-Rad Laboratories Inc. | #5000006 | bradford assay kit to determine protein stock concentrations |
biotin labeled bovine albumin | Sigma Aldrich | #A8549 | examplary protein that can be used as standard protein for MSPT |
cholera toxin subunit B | Sigma Aldrich | #SAE0069 | examplary membrane-interacting protein |
cover glasses, #1.5, 24 x 24 mm | Paul Marienfeld GmbH & Co. KG | #0102062 | |
cover glasses, #1.5, 24 x 60 mm | Paul Marienfeld GmbH & Co. KG | #0102242 | |
dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) | Avanti Polar Lipids | #850375 | lipid – in the form of extruded small unilamellar vesicles required for supported lipid bilayer formation |
dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-cap biotinyl (18:1 Biotinyl Cap PE | Avanti Polar Lipids | #870273 | lipid – in the form of extruded small unilamellar vesicles required for supported lipid bilayer formation |
dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol (DOPG) | Avanti Polar Lipids | #840475 | lipid – in the form of extruded small unilamellar vesicles required for supported lipid bilayer formation |
dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (DOPS) | Avanti Polar Lipids | #840035 | lipid – in the form of extruded small unilamellar vesicles required for supported lipid bilayer formation |
double-sided tape | tesa | #57912-00000-02 | needed for the assembly of glass sample chambers |
Extruder | Avanti Polar Lipids | #610023 | Lipid extruder to enable monodisperse vesicle distributions |
EZ-Link Maleimide-PEG2-Biotin | Thermo Fisher Scientific | #A39261 | maileimide-fused biotin that can be used to biotinylate standard proteins for MSPT |
Fibronectin (Biotinylated) | Cytoskeleton Inc. | #FNR03-A | examplary protein that can be used as standard protein for MSPT |
Gel Filtration HMW Calibration Kit | Cytiva | #28403842 | standard proteins, e.g. aldolase that can be biotinylated and used as molecular weight standards for MSPT |
GM1 Ganglioside (Brain, Ovine-Sodium Salt) | Avanti Polar Lipids | #860065 | lipid – in the form of extruded small unilamellar vesicles required for supported lipid bilayer formation |
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Biotin | Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA) | #31820 | examplary protein to highlight the existence of different protein states |
Isopropanol, 99.5%, for spectroscopy | Thermo Fisher Scientific | #10003643 | |
Low Autofluorescence Immersion Oil | Olympus K.K. | #IMMOIL-F30CC | |
pET21a-Streptavidin-Alive | Addgene | #20860 | required to express and purify divalent streptavidin in combination with each other |
pET21a-Streptavidin-Dead | Addgene | #20859 | required to express and purify divalent streptavidin in combination with each other |
Pierce Alkaline Phosphatase, biotinylated | Thermo Fisher Scientific | #29339 | examplary protein that can be used as standard protein for MSPT |
Pierce Protein A, Biotinylated | Thermo Fisher Scientific | #29989 | examplary protein that can be used as standard protein for MSPT |
Refeyn Acquire | Refeyn Ltd. | control software for Refeyn OneMP | |
Refeyn One | Refeyn Ltd. | – | mass photometer |
sterile syringe filters 0.45 µm cellulose acetate membrane | VWR International | #514-0063 | needed to filter particles from the buffer of interest |
tetravalent streptavidin | Thermo Fisher Scientific | #SNN1001 | tetravalent streptavidin to enable the presence of several biotin binding sites |
Whatman Nuclepore Hydrophilic Membrane, 0.05 µm Pore Size, 25 mm Circle | Cytiva | #110603 | a pore size of 50 nm is recommended for supported lipid bilayer formation in the context of MSPT |
Zepto model 2 plasma cleaner | Diener electronic GmbH | – |