यह प्रोटोकॉल एक iSCAT-आधारित छवि प्रसंस्करण और एकल-कण ट्रैकिंग दृष्टिकोण का वर्णन करता है जो आणविक द्रव्यमान की एक साथ जांच और लिपिड झिल्ली के साथ बातचीत करने वाले मैक्रोमोलेक्यूल्स के विसर्पण व्यवहार को सक्षम बनाता है। नमूना तैयारी, मास-टू-कंट्रास्ट रूपांतरण, फिल्म अधिग्रहण और पोस्ट-प्रोसेसिंग के लिए चरण-दर-चरण निर्देश संभावित नुकसान को रोकने के लिए दिशाओं के साथ प्रदान किए जाते हैं।
लिपिड झिल्ली पर और उसके साथ मैक्रोमोलेक्यूल्स की अल्पकालिक या क्षणिक बातचीत, एक इंटरफ़ेस जहां आवश्यक जैविक प्रतिक्रियाओं की एक भीड़ होती है, मानक बायोफिजिकल तरीकों के साथ मूल्यांकन करना स्वाभाविक रूप से मुश्किल होता है। बड़े पैमाने पर संवेदनशील कण ट्रैकिंग (MSPT) की शुरूआत इस तरह की प्रक्रियाओं के एक पूरी तरह से मात्रात्मक लक्षण वर्णन की दिशा में एक महत्वपूर्ण कदम का गठन करती है। तकनीकी रूप से, यह इंटरफेरोमेट्रिक स्कैटरिंग माइक्रोस्कोपी (आईएससीएटी) -आधारित मास फोटोमेट्री (एमपी) के आगमन के माध्यम से संभव बनाया गया था। जब पृष्ठभूमि हटाने की रणनीति को झिल्ली से जुड़े कणों की दो-आयामी गति को प्रकट करने के लिए अनुकूलित किया जाता है, तो यह तकनीक जैविक झिल्ली पर बिना लेबल वाले मैक्रोमोलेक्यूल्स के प्रसार और आणविक द्रव्यमान दोनों के वास्तविक समय के विश्लेषण की अनुमति देती है। यहां, झिल्ली से जुड़े सिस्टम के बड़े पैमाने पर संवेदनशील कण ट्रैकिंग को करने और विश्लेषण करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है। एक वाणिज्यिक द्रव्यमान फोटोमीटर पर किए गए माप मिलीसेकंड शासन में समय संकल्प प्राप्त करते हैं और, एमपी सिस्टम के आधार पर, 50 केडीए तक एक द्रव्यमान का पता लगाने की सीमा। सामान्य रूप से झिल्ली-उत्प्रेरित मैक्रोमोलेक्यूल गतिशीलता के गहन विश्लेषण के लिए एमएसपीटी की क्षमता का प्रदर्शन करने के लिए, देशी झिल्ली इंटरैक्टर एनेक्सिन वी जैसे अनुकरणीय प्रोटीन प्रणालियों के लिए प्राप्त परिणाम प्रस्तुत किए जाते हैं।
एक बार केवल परिवेशी भौतिक स्थितियों की विस्तृत श्रृंखला के खिलाफ एक बाधा के रूप में माना जाता है, जैविक झिल्ली को आजकल कार्यात्मक संस्थाओं और उत्प्रेरक प्लेटफार्मों 1,2 माना जाता है। झिल्ली से जुड़े मैक्रोमोलेक्यूल प्रतिक्रियाओं के जवाब में स्थानीयकरण, प्रवर्धित और प्रत्यक्ष संकेतों की उनकी क्षमता के आधार पर, लिपिड इंटरफेस झिल्ली तस्करी और सिग्नलिंग कैस्केड 3,4,5 जैसी विभिन्न प्रकार की सेलुलर प्रक्रियाओं के लिए एक महत्वपूर्ण तत्व का गठन करते हैं। स्थिर परिसरों की असेंबली के लिए एक न्यूक्लिएशन साइट के रूप में कार्य करते हुए, झिल्ली अनुलग्नक अक्सर मैक्रोमोलेक्यूल्स के झिल्ली से जुड़े और साइटोसोलिक रूपों के बीच एक गतिशील संतुलन पर निर्भर करता है और इसलिए क्षणिक प्रकृति 6,7 का होता है।
जीव विज्ञान में उनके महान महत्व के बावजूद, यह अब तक उन तरीकों को विकसित करने के लिए चुनौतीपूर्ण रहा है जो वास्तविक समय 7,8 में झिल्ली से जुड़े मैक्रोमोलेक्यूल प्रतिक्रियाओं की रचनात्मक, स्थानिक और अस्थायी विषमताओं तक पहुंच प्रदान कर सकते हैं। अंतर्निहित आणविक प्रक्रियाओं को हल करने के लिए, दो प्रयोगात्मक पहलू निर्णायक हैं: पर्याप्त समय संकल्प और एकल-कण संवेदनशीलता। इसलिए, कलाकारों की टुकड़ी औसत तकनीकों जैसे कि फोटोब्लीचिंग (एफआरएपी) के बाद प्रतिदीप्ति वसूली, लेकिन बहुत अधिक संवेदनशील प्रतिदीप्ति सहसंबंध स्पेक्ट्रोस्कोपी (एफसीएस) की सीमाएं भी हैं, क्योंकि वे काफी हद तक अस्थायी जानकारी9 से स्थानिक जानकारी को अनकपल करते हैं। व्यक्तिगत अणु गतिशीलता के लक्षण वर्णन की दिशा में एक महत्वपूर्ण कदम इस प्रकार अत्यधिक संवेदनशील माइक्रोस्कोपी के साथ संयोजन में एकल-कण ट्रैकिंग (एसपीटी) का आगमन रहा है। विशेष रूप से, दो एसपीटी दृष्टिकोण इस संबंध में प्रभावी साबित हुए हैं। सबसे पहले, लेबल के रूप में फ्लोरोफोरस के उपयोग और इसी प्रतिदीप्ति का पता लगाने वाली प्रणालियों ने नैनोमीटर परिशुद्धता और मिलीसेकंड समय रिज़ॉल्यूशन10,11,12 के लिए मार्ग प्रशस्त किया। दूसरे, सोने के नैनोकणों का उपयोग करके प्रकीर्णन-आधारित पता लगाने ने स्थानीयकरण परिशुद्धता और समय रिज़ॉल्यूशन दोनों में सुधार किया उप-नैनोमीटर और माइक्रोसेकंड रेंज, क्रमशः 13,14,15,16। दोनों दृष्टिकोणों के कई फायदों और झिल्ली से जुड़े प्रणालियों17,18 की यांत्रिक समझ के बारे में उनके महत्वपूर्ण योगदान के बावजूद, दोनों तकनीकों को अब तक सीमित किया गया है: उन्हें ब्याज के अणुओं के लेबलिंग की आवश्यकता होती है, जो संभावित रूप से उनके मूल व्यवहार को परेशान करता है और झिल्ली से जुड़े कणों की आणविक संरचना के प्रति असंवेदनशील हैं19,20।
इन दोनों सीमाओं को हाल ही में एक उपन्यास इंटरफेरोमेट्रिक स्कैटरिंग (आईएससीएटी) -आधारित दृष्टिकोण की शुरूआत से दूर कर दिया गया है जिसे मास फोटोमेट्री (एमपी) 21,22,23 कहा जाता है। यह तकनीक ग्लास इंटरफ़ेस पर उतरते समय बायोमोलेक्यूल्स के इन-सॉल्यूशन मास डिस्ट्रीब्यूशन के निर्धारण को उनके आईएससीएटी कंट्रास्ट के अनुसार अनुमति देती है। हालांकि, लिपिड झिल्ली पर अलग-अलग मोबाइल अणुओं का पता लगाने और लक्षण वर्णन के लिए, एक अधिक परिष्कृत छवि विश्लेषण दृष्टिकोण विकसित किया जाना था। यह इस बीच सफलतापूर्वक लागू किया गया है और एक लिपिड इंटरफ़ेस24,25 पर अलग-अलग एकल लेबल वाले बायोमोलेक्यूल्स के आणविक द्रव्यमान का पता लगाने, ट्रैक करने और निर्धारित करने की अनुमति देता है। गतिशील द्रव्यमान फोटोमेट्री या द्रव्यमान-संवेदनशील कण ट्रैकिंग (MSPT) के रूप में संदर्भित, यह तकनीक अब ट्रैक की गई संस्थाओं के आणविक द्रव्यमान में परिवर्तनों को सीधे रिकॉर्ड करके जटिल मैक्रोमोलेक्यूल इंटरैक्शन के मूल्यांकन को सक्षम बनाती है और इसलिए झिल्ली से जुड़े आणविक गतिशीलता के यांत्रिक विश्लेषण के लिए नई संभावनाओं को खोलती है।
यहां, नमूना तैयारी, इमेजिंग और MSPT के लिए आवश्यक डेटा विश्लेषण पाइपलाइन के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया गया है। विशेष रूप से, नमूना आवश्यकताओं और संभावित समस्याओं पर चर्चा की जाती है जो माप और विश्लेषण के दौरान हो सकती हैं। इसके अलावा, झिल्ली-बातचीत मैक्रोमोलेक्यूल सिस्टम का विश्लेषण करने की अद्वितीय क्षमता को विभिन्न प्रतिनिधि परिणामों के माध्यम से प्रदर्शित किया जाता है।
प्रस्तुत प्रोटोकॉल बड़े पैमाने पर फोटोमेट्री21 का विस्तार करता है, एक ऐसी तकनीक जो कांच पर adsorbing एकल बायोमोलेक्यूल्स के द्रव्यमान का विश्लेषण करती है, एक और भी अधिक बहुमुखी उपकरण है जो बिना लेबल वाले झिल्ली-इंटरैक्टिंग बायोमोलेक्यूल्स के द्रव्यमान और प्रसार को एक साथ मापने में सक्षम है। यह विश्लेषण विस्तारअणुओं 24,25 की पार्श्व गति के लिए अनुकूलित एक संशोधित पृष्ठभूमि हटाने की रणनीति के कार्यान्वयन के माध्यम से प्राप्त किया जाता है। सामान्य तौर पर, पृष्ठभूमि हटाने iSCAT-आधारित दृष्टिकोण के लिए अत्यंत महत्वपूर्ण है, क्योंकि कांच की सतह खुरदरापन का मजबूत प्रकीर्णन मुख्य विश्लेषण बाधा का प्रतिनिधित्व करता है, और प्रत्येक पिक्सेल की स्थानीय पृष्ठभूमि का सटीक निर्धारण कण द्रव्यमान और स्थान के परिमाणीकरण के लिए आवश्यक है। कण गति के लिए अनुकूलित छवि-विश्लेषण के अलावा, बाद में कण का पता लगाने, प्रक्षेपवक्र जोड़ने, और डेटा विश्लेषण बड़े पैमाने पर संवेदनशील कण ट्रैकिंग (MSPT) में एमपी के उपन्यास विस्तार को पूरा करते हैं।
सामान्य तौर पर, पूरी तरह से साफ ग्लास कवर स्लाइड और एक स्वच्छ कार्य वातावरण MSPT प्रयोगों के सफल प्रदर्शन के लिए महत्वपूर्ण आवश्यकताएं हैं। मैक्रोमोलेक्यूल लेबलिंग की अनुपस्थिति के कारण, अधिग्रहित सिग्नल स्वाभाविक रूप से गैर-चयनात्मक है। स्वच्छ नमूने, साथ ही उचित नमूना हैंडलिंग, इसलिए यह सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण हैं कि टिप्पणियों की गलत व्याख्या नहीं की जा सकती है। विशेष रूप से, जब कम आणविक भार के अणुओं की जांच की जाती है, तो पृष्ठभूमि योगदान (पूरक चित्रा 1) का आकलन करने के लिए प्रोटीन मुक्त झिल्ली के नियंत्रण माप का समर्थन किया जाता है। नियंत्रण माप को शामिल करने के अलावा, इस प्रकार प्रत्येक प्रवाह कक्ष के लिए चित्र2 में प्रदर्शित तैयारी चरणों का पालन करने की सिफारिश की जाती है। जब संयुक्त किया जाता है, तो ये सुरक्षा उपाय यह सुनिश्चित करेंगे कि पता लगाया गया संकेत ब्याज के बायोमोलेक्यूल से उत्पन्न होता है और उदाहरण के लिए, एक दूषित प्रवाह कक्ष, बफर या झिल्ली नहीं।
प्रायोगिक डिजाइन के बारे में सावधानियों के अलावा, MSPT छवि प्रसंस्करण के दौरान भी देखभाल की जरूरत है। वीडियो प्रोसेसिंग के दौरान, सही परिणाम सुनिश्चित करने के लिए तीन पैरामीटर के लिए मान को सावधानीपूर्वक चुना जाना चाहिए: i) पृष्ठभूमि हटाने के लिए माध्यिका विंडो की लंबाई, ii) कण का पता लगाने के लिए दहलीज, और iii) लिंकिंग असाइनमेंट के दौरान अधिकतम खोज त्रिज्या। एक बड़ी माध्यिका खिड़की (i) आमतौर पर अधिरोपित अर्ध-स्थिर पृष्ठभूमि से अलग कणों के पृथक्करण की सुविधा प्रदान करती है। हालांकि, बहुत बड़ी खिड़की के आकार के लिए नमूना बहाव अंततः ध्यान देने योग्य हो जाएगा और पृष्ठभूमि अनुमान की सटीकता को कम कर देगा। इष्टतम सेटिंग्स नमूना गुणों और माप स्थितियों पर बहुत अधिक निर्भर करती हैं। फिर भी, 1,001 के मूल्य का उपयोग एक मजबूत प्रारंभिक बिंदु के रूप में किया जा सकता है। थ्रेशोल्ड पैरामीटर (ii) को नमूने में अपेक्षित सबसे कम आणविक द्रव्यमान के आधार पर ट्यून किया जाना चाहिए। इस अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले द्रव्यमान फोटोमीटर के साथ लिए गए माप के लिए 0.0005 से नीचे के मान की सिफारिश नहीं की जाती है। विश्लेषण समय को गति देने के लिए, उच्च मूल्यों को चुना जा सकता है यदि उच्च आणविक वजन वाले नमूने की उम्मीद की जाती है। प्रक्षेपवक्र लिंकिंग (iii) में खोज त्रिज्या पिक्सेल में अधिकतम रेडियल दूरी को निर्दिष्ट करती है जिसमें कण के स्थानांतरित स्थान को लगातार फ्रेम में खोजा जाएगा। इसे नमूने में सबसे तेज़ कण के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए, और, यदि इष्ट किया जाता है, तो गणना समय को कम करने के बजाय एक अनुकूली खोज रेंज ( trackpy के प्रलेखन देखें) का उपयोग किया जा सकता है। विशेष रूप से एक परियोजना के प्रारंभिक चरण के दौरान, प्राप्त परिणामों को मान्य करने के लिए अलग-अलग मापदंडों के साथ फिल्मों का फिर से विश्लेषण करने की सिफारिश की जाती है।
MSPT की एकल-अणु प्रकृति के प्रकाश में, इसे उच्च झिल्ली कण घनत्व पर मापने से बचा जाना चाहिए क्योंकि वे सटीक विपरीत और द्रव्यमान निर्धारण में हस्तक्षेप कर सकते हैं। यह दिखाया गया है कि प्रति वर्ग माइक्रोमीटर प्रति एक कण से नीचे घनत्व MSPT माप24 के लिए अनुकूल हैं। एक अतिरिक्त विचार नमूने में अपेक्षित प्रसार गुणांक है। हालांकि प्रसार गुणांक की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए लागू होता है, MSPT में सुलभ प्रसार गुणांक की एक कम सीमा होती है। माध्यिका विंडो अवधि के एक महत्वपूर्ण हिस्से के दौरान कुछ पिक्सेल के क्षेत्र के लिए स्थानीय कारावास कण को स्थैतिक पृष्ठभूमि के साथ विलय कर देता है। इस प्रोटोकॉल में उपयोग की जाने वाली इमेजिंग स्थितियों के लिए, 0.01 μm2/s से नीचे प्रसार गुणांक के माप की सिफारिश नहीं की जाती है। इस प्रसार की गति पर, उदाहरण के लिए, माध्यिका खिड़की के आधे आकार के दौरान एक कण का औसत वर्गित विस्थापन लगभग 4 पिक्सेल है और इसलिए पीएसएफ की सीमा के समान आकार का है। नतीजतन, स्थैतिक पृष्ठभूमि अनुमान में कण से ही सिग्नल योगदान होने की संभावना है, जिसके परिणामस्वरूप कण के स्पष्ट रूप से कम विपरीत होते हैं जब तक कि यह अंततः शोर स्तर तक नहीं पहुंच जाता है। हालांकि, 0.05 और 10 μm2/s के बीच के मैक्रोमोलेक्यूल प्रसार गुणांक को स्पष्ट रूप से हल किया जा सकता है।
MSPT अनुप्रयोगों की सीमा को आगे बढ़ाने के लिए, कोई भी पिक्सेल के उन्मूलन के माध्यम से माध्य-आधारित पृष्ठभूमि एल्गोरिथ्म की उन्नति की कल्पना कर सकता है जो अस्थायी रूप से कण के साथ कब्जा कर लिया जाता है, या नमूना बहाव सुधार द्वारा बड़े माध्यिका विंडो आकार को सक्षम करता है। दोनों दृष्टिकोण उच्च कण घनत्व और धीमी गति से प्रसार पर माप के बारे में समस्याओं को कम करेंगे। कम द्रव्यमान संवेदनशीलता के संदर्भ में सुधार बड़े पैमाने पर फोटोमीटर की एक नई पीढ़ी के साथ क्षितिज पर हैं, जो 50 केडीए से छोटे बायोमोलेक्यूल्स तक पहुंच प्रदान कर सकते हैं। इसलिए, भविष्य के MSPT प्रयोगों को एकल-अणु गतिशीलता और झिल्ली से संबंधित इंटरैक्शन का अध्ययन करने में सक्षम होगा, जो झिल्ली की नकल की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए है जैसे कि कुशन्ड बाईलेयर और मैक्रोमोलेक्यूलर सिस्टम।
The authors have nothing to disclose.
हम ईमानदारी से फिलिप कुकुरा, गेविन यंग और रेफिन सॉफ्टवेयर टीम के समर्थन की सराहना करते हैं और छवि विश्लेषण कोड के कुछ हिस्सों को साझा करके उनकी सहायता को स्वीकार करते हैं। हम वाणिज्यिक Refeyn मास फोटोमीटर तक पहुंच प्रदान करने के लिए क्रायो-EM MPIB कोर सुविधा को धन्यवाद देते हैं। F.S. कृतज्ञतापूर्वक Jürgen Plitzko और Wolfgang Baumeister द्वारा दिए गए समर्थन और वित्त पोषण को स्वीकार करता है। टी.एच. और पी.एस. को ड्यूश Forschungsgemeinschaft (DFG, जर्मन रिसर्च फाउंडेशन) के माध्यम से धन प्राप्त हुआ – प्रोजेक्ट-आईडी 201269156 – SFB 1032 (A09)। N.H. एक DFG वापसी अनुदान HU 2462/3-1 द्वारा समर्थित किया गया था। पी.एस. जर्मन संघीय शिक्षा और अनुसंधान मंत्रालय (BMBF) और मैक्स प्लैंक सोसाइटी की संयुक्त वित्त पोषण पहल के माध्यम से अनुसंधान नेटवर्क MaxSynBio के माध्यम से समर्थन स्वीकार करता है।
annexin V | Sigma Aldrich | #SRP8026 | examplary membrane-interacting protein |
Bio-Rad Protein Assay | Bio-Rad Laboratories Inc. | #5000006 | bradford assay kit to determine protein stock concentrations |
biotin labeled bovine albumin | Sigma Aldrich | #A8549 | examplary protein that can be used as standard protein for MSPT |
cholera toxin subunit B | Sigma Aldrich | #SAE0069 | examplary membrane-interacting protein |
cover glasses, #1.5, 24 x 24 mm | Paul Marienfeld GmbH & Co. KG | #0102062 | |
cover glasses, #1.5, 24 x 60 mm | Paul Marienfeld GmbH & Co. KG | #0102242 | |
dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) | Avanti Polar Lipids | #850375 | lipid – in the form of extruded small unilamellar vesicles required for supported lipid bilayer formation |
dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-cap biotinyl (18:1 Biotinyl Cap PE | Avanti Polar Lipids | #870273 | lipid – in the form of extruded small unilamellar vesicles required for supported lipid bilayer formation |
dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol (DOPG) | Avanti Polar Lipids | #840475 | lipid – in the form of extruded small unilamellar vesicles required for supported lipid bilayer formation |
dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (DOPS) | Avanti Polar Lipids | #840035 | lipid – in the form of extruded small unilamellar vesicles required for supported lipid bilayer formation |
double-sided tape | tesa | #57912-00000-02 | needed for the assembly of glass sample chambers |
Extruder | Avanti Polar Lipids | #610023 | Lipid extruder to enable monodisperse vesicle distributions |
EZ-Link Maleimide-PEG2-Biotin | Thermo Fisher Scientific | #A39261 | maileimide-fused biotin that can be used to biotinylate standard proteins for MSPT |
Fibronectin (Biotinylated) | Cytoskeleton Inc. | #FNR03-A | examplary protein that can be used as standard protein for MSPT |
Gel Filtration HMW Calibration Kit | Cytiva | #28403842 | standard proteins, e.g. aldolase that can be biotinylated and used as molecular weight standards for MSPT |
GM1 Ganglioside (Brain, Ovine-Sodium Salt) | Avanti Polar Lipids | #860065 | lipid – in the form of extruded small unilamellar vesicles required for supported lipid bilayer formation |
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Biotin | Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA) | #31820 | examplary protein to highlight the existence of different protein states |
Isopropanol, 99.5%, for spectroscopy | Thermo Fisher Scientific | #10003643 | |
Low Autofluorescence Immersion Oil | Olympus K.K. | #IMMOIL-F30CC | |
pET21a-Streptavidin-Alive | Addgene | #20860 | required to express and purify divalent streptavidin in combination with each other |
pET21a-Streptavidin-Dead | Addgene | #20859 | required to express and purify divalent streptavidin in combination with each other |
Pierce Alkaline Phosphatase, biotinylated | Thermo Fisher Scientific | #29339 | examplary protein that can be used as standard protein for MSPT |
Pierce Protein A, Biotinylated | Thermo Fisher Scientific | #29989 | examplary protein that can be used as standard protein for MSPT |
Refeyn Acquire | Refeyn Ltd. | control software for Refeyn OneMP | |
Refeyn One | Refeyn Ltd. | – | mass photometer |
sterile syringe filters 0.45 µm cellulose acetate membrane | VWR International | #514-0063 | needed to filter particles from the buffer of interest |
tetravalent streptavidin | Thermo Fisher Scientific | #SNN1001 | tetravalent streptavidin to enable the presence of several biotin binding sites |
Whatman Nuclepore Hydrophilic Membrane, 0.05 µm Pore Size, 25 mm Circle | Cytiva | #110603 | a pore size of 50 nm is recommended for supported lipid bilayer formation in the context of MSPT |
Zepto model 2 plasma cleaner | Diener electronic GmbH | – |