Denne protokollen beskriver en iSCAT-basert bildebehandling og enkeltpartikkelsporingstilnærming som muliggjør samtidig undersøkelse av molekylmassen og den diffusive oppførselen til makromolekyler som samhandler med lipidmembraner. Trinnvise instruksjoner for prøveforberedelse, masse-til-kontrast-konvertering, filmanskaffelse og etterbehandling er gitt sammen med retninger for å forhindre potensielle fallgruver.
Kortvarige eller forbigående interaksjoner mellom makromolekyler på og med lipidmembraner, et grensesnitt der en rekke essensielle biologiske reaksjoner finner sted, er iboende vanskelig å vurdere med standard biofysiske metoder. Innføringen av massesensitiv partikkelsporing (MSPT) utgjør et viktig skritt mot en grundig kvantitativ karakterisering av slike prosesser. Teknisk sett ble dette mulig gjennom fremkomsten av interferometrisk spredningsmikroskopi (iSCAT)-basert massefotometri (MP). Når bakgrunnsfjerningsstrategien er optimalisert for å avsløre den todimensjonale bevegelsen av membranrelaterte partikler, tillater denne teknikken sanntidsanalyse av både diffusjon og molekylær masse av umerkede makromolekyler på biologiske membraner. Her beskrives en detaljert protokoll for å utføre og analysere massesensitiv partikkelsporing av membranrelaterte systemer. Målinger utført på et kommersielt massefotometer oppnår tidsoppløsning i millisekundregimet og, avhengig av MP-systemet, en massedeteksjonsgrense ned til 50 kDa. For å vise frem potensialet til MSPT for grundig analyse av membrankatalysert makromolekyldynamikk generelt, presenteres resultater oppnådd for eksemplariske proteinsystemer som det opprinnelige membraninteragereriet annexin V.
En gang bare oppfattet som en barriere mot det brede spekteret av omgivelses fysiske forhold, anses biologiske membraner i dag som funksjonelle enheter og katalytiske plattformer 1,2. Basert på deres evne til å lokalisere, forsterke og direkte signaler som svar på membranrelaterte makromolekylreaksjoner, utgjør lipidgrensesnitt et avgjørende element for et bredt spekter av cellulære prosesser som membranhandel og signalkaskade 3,4,5. Membrantilknytning fungerer som et kjerneanlegg for montering av stabile komplekser, og er ofte avhengig av en dynamisk likevekt mellom membranrelaterte og cytosoliske former for makromolekyler og er derfor av forbigående natur 6,7.
Til tross for deres store betydning i biologien, har det så langt vært utfordrende å utvikle metoder som kan gi tilgang til komposisjonelle, romlige og tidsmessige heterogeniteter av membranrelaterte makromolekylreaksjoner i sanntid 7,8. For å løse de underliggende molekylære prosessene er to eksperimentelle aspekter avgjørende: tilstrekkelig tidsoppløsning og enpartikkelfølsomhet. Derfor har ensemblegjennomsnittsteknikker som fluorescensgjenvinning etter fotobleaching (FRAP), men også den mye mer følsomme fluorescenskorrelasjonsspektroskopien (FCS) begrensninger, siden de i stor grad unouthil romlig informasjon fra temporal informasjon9. Et viktig skritt mot karakterisering av individuelle molekyldynamikker har dermed vært fremveksten av enkeltpartikkelsporing (SPT) i kombinasjon med svært sensitiv mikroskopi. Spesielt har to SPT-tilnærminger vist seg å være effektive i denne forbindelse. For det første banet bruken av fluoroforer som etiketter og de tilsvarende fluorescensdeteksjonssystemene veien for nanometerpresisjon og millisekunders tidsoppløsning 10,11,12. For det andre forbedret spredningsbasert deteksjon ved hjelp av gull nanopartikler både lokaliseringspresisjon og tidsoppløsning til under nanometer- og mikrosekundområdet, henholdsvis 13,14,15,16. Til tross for de mange fordelene med både tilnærminger og deres betydelige bidrag til den mekanistiske forståelsen av membranrelaterte systemer17,18, har begge teknikkene så langt vært begrenset: de krever merking av molekylene av interesse, som potensielt perturberer deres opprinnelige oppførsel og er ufølsomme for den molekylære sammensetningen av membranrelaterte partikler19,20.
Begge disse begrensningene har nylig blitt overvunnet ved innføringen av en ny interferometrisk spredning (iSCAT)-basert tilnærming kalt massefotometri (MP) 21,22,23. Denne teknikken gjør det mulig å bestemme massedistribusjoner av biomolekyler i henhold til iSCAT-kontrasten når de lander på et glassgrensesnitt. Men for deteksjon og karakterisering av mobile molekyler som diffuserer på lipidmembraner, måtte det utvikles en mer sofistikert bildeanalysetilnærming. Dette har i mellomtiden blitt implementert og gjør det mulig å oppdage, spore og bestemme den molekylære massen av enkle umerkede biomolekyler som sprer seg på et lipidgrensesnitt24,25. Denne teknikken kalles dynamisk massefotometri eller massesensitiv partikkelsporing (MSPT), og muliggjør nå vurdering av komplekse makromolekylelle interaksjoner ved direkte registrering av endringer i den molekylære massen av de sporede enhetene og åpner dermed for nye muligheter for mekanistisk analyse av membranrelatert molekylær dynamikk.
Her presenteres en detaljert protokoll for prøveforberedelse, avbildning og dataanalyseforløpet som kreves for MSPT. Spesielt diskuteres utvalgskrav og potensielle problemer som kan oppstå under måling og analyse. Videre vises det enestående potensialet til å analysere membraninteragerende makromolekylsystemer gjennom ulike representative resultater.
Den presenterte protokollen utvider massefotometri21, en teknikk som analyserer massen av enkelt biomolekyler som adsorkulerer på glass, til et enda mer allsidig verktøy som samtidig kan måle massen og diffusjonen av umerkede membraninteragerende biomolekyler. Denne analyseutvidelsen oppnås gjennom implementering av en modifisert bakgrunnsfjerningsstrategi tilpasset molekylenes laterale bevegelse24,25. Generelt er bakgrunnsfjerningen av største betydning for iSCAT-baserte tilnærminger, siden den sterke spredningen av glassoverflatens grovhet representerer hovedanalysehindringen, og den nøyaktige bestemmelsen av hver piksels lokale bakgrunn er avgjørende for kvantifisering av partikkelmasse og plassering. Foruten bildeanalysen tilpasset partikkelbevegelse, fullfører påfølgende partikkeldeteksjon, banekobling og dataanalyse den nye utvidelsen av MP til massesensitiv partikkelsporing (MSPT).
Generelt er grundig rensede glassdekselsklier og et rent arbeidsmiljø kritiske krav for vellykket ytelse av MSPT-eksperimenter. På grunn av fraværet av makromolekylmerking er det oppkjøpte signalet iboende ikke-selektivt. Rene prøver, samt riktig prøvehåndtering, er derfor avgjørende for å sikre at observasjoner ikke kan feiltolkes. Spesielt når molekyler med lav molekylvekt undersøkes, er kontrollmålinger av proteinfrie membraner godkjent for å vurdere bakgrunnsbidrag (supplerende figur 1). I tillegg til å inkludere kontrollmålinger, anbefales det derfor å følge forberedelsestrinnene som vises i figur 2 for hvert strømningskammer. Når de kombineres, vil disse sikkerhetstiltakene sikre at det oppdagede signalet stammer fra biomolekylet av interesse og ikke for eksempel et forurenset strømningskammer, buffer eller membran.
I tillegg til forholdsregler angående eksperimentell design, må det også tas hensyn til under MSPT-bildebehandling. Under videobehandling bør verdien for tre parametere velges nøye for å sikre riktige resultater: i) lengden på medianvinduet for fjerning av bakgrunn, ii) terskelen for partikkeldeteksjon, og iii) maksimal søkeradius under koblingsoppdraget. Et større medianvindu (i) letter generelt separasjonen av diffuserende partikler fra den overliggende kvasikonstante bakgrunnen. Men for for store vindusstørrelser vil prøvedriften etter hvert bli merkbar og redusere nøyaktigheten av bakgrunnsestimeringen. Optimale innstillinger avhenger sterkt av prøveegenskaper og måleforhold. Likevel kan en verdi på 1001 brukes som et robust utgangspunkt. Terskelparameteren (ii) må justeres avhengig av den laveste molekylære massen som forventes i prøven. En verdi under 0,0005 anbefales ikke for målinger tatt med massefotometeret som brukes i denne studien. For å øke analysetidene kan du velge høyere verdier hvis en prøve med høy molekylvekt forventes. Søkeradiusen i banekobling (iii) angir den maksimale radialavstanden i piksler der partikkelens forskjøvet plassering skal søkes etter i påfølgende rammer. Det bør tilpasses den raskeste partikkelen i prøven, og hvis det favoriseres, kan et adaptivt søkeområde (se dokumentasjon av trackpy) brukes i stedet for å redusere beregningstiden. Spesielt i den første fasen av et prosjekt anbefales det å analysere filmene på nytt med varierende parametere for å validere de oppnådde resultatene.
I lys av MSPTs enkeltmolekyls natur bør det unngås å måle ved høye membranpartikkeltettheter, da de kan forstyrre nøyaktig kontrast og massebestemmelse. Det har vist seg at tettheter under en partikkel per kvadrert mikrometer er gunstige for MSPT-målinger24. En ekstra vurdering er de forventede diffusjonskoeffisientene i prøven. Selv om MSPT gjelder for et bredt spekter av diffusjonskoeffisienter, har MSPT en nedre grense for tilgjengelige diffusjonskoeffisienter. Lokal innesperring til et område på få piksler i en betydelig del av medianvindusperioden slår sammen partikkelen med den statiske bakgrunnen. For bildeforholdene som brukes i denne protokollen, anbefales ikke måling av diffusjonskoeffisienter under 0,01 μm2/s. Ved denne diffusjonshastigheten, for eksempel, er den gjennomsnittlige kvadrerte forskyvningen av en partikkel under medianvinduets halvstørrelse ca. 4 piksler og dermed av lignende størrelse som omfanget av PSF. Som en konsekvens vil det statiske bakgrunnsestimatet sannsynligvis inneholde signalbidrag fra selve partikkelen, noe som resulterer i en tilsynelatende redusert kontrast av partikkelen til den til slutt nærmer seg støynivået. Imidlertid kan makromolekyler diffusjonskoeffisienter mellom 0,05 og 10 μm2/s tydelig løses.
For ytterligere å utvide spekteret av MSPT-applikasjoner, kan man se for seg en fremgang av den medianbaserte bakgrunnsalgoritmen gjennom eliminering av piksler som midlertidig er opptatt med en partikkel, eller ved prøvedriftskorrigering som muliggjør større medianvindustørrelser. Begge tilnærmingene ville lindre problemene med målinger ved høye partikkeltettheter og langsom diffusjon. Forbedringer når det gjelder lavere massefølsomhet er i horisonten med en ny generasjon massefotometre, som kan gi tilgang til biomolekyler mindre enn 50 kDa. Derfor vil fremtidige MSPT-eksperimenter kunne studere enkeltmolekyldynamikk og membranrelaterte interaksjoner for et enda bredere spekter av membranimileringer som polstrede bilayers og makromolekylære systemer.
The authors have nothing to disclose.
Vi setter stor pris på støtten fra Philipp Kukura, Gavin Young og Refeyn-programvareteamet og anerkjenner deres hjelp ved å dele deler av bildeanalysekoden. Vi takker Cryo-EM MPIB Core Facility for å gi tilgang til det kommersielle Refeyn-massefotometeret. F.S. anerkjenner takknemlig støtten og finansieringen gitt av Jürgen Plitzko og Wolfgang Baumeister. T.H. og P.S. fikk støtte gjennom Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, German Research Foundation) – Project-ID 201269156 – SFB 1032 (A09). N.H. ble støttet av et DFG-returstipend HU 2462/3-1. P.S. anerkjenner støtte gjennom forskningsnettverket MaxSynBio via det felles finansieringsinitiativet til det tyske føderale utdannings- og forskningsdepartementet (BMBF) og Max Planck Society.
annexin V | Sigma Aldrich | #SRP8026 | examplary membrane-interacting protein |
Bio-Rad Protein Assay | Bio-Rad Laboratories Inc. | #5000006 | bradford assay kit to determine protein stock concentrations |
biotin labeled bovine albumin | Sigma Aldrich | #A8549 | examplary protein that can be used as standard protein for MSPT |
cholera toxin subunit B | Sigma Aldrich | #SAE0069 | examplary membrane-interacting protein |
cover glasses, #1.5, 24 x 24 mm | Paul Marienfeld GmbH & Co. KG | #0102062 | |
cover glasses, #1.5, 24 x 60 mm | Paul Marienfeld GmbH & Co. KG | #0102242 | |
dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) | Avanti Polar Lipids | #850375 | lipid – in the form of extruded small unilamellar vesicles required for supported lipid bilayer formation |
dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-cap biotinyl (18:1 Biotinyl Cap PE | Avanti Polar Lipids | #870273 | lipid – in the form of extruded small unilamellar vesicles required for supported lipid bilayer formation |
dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol (DOPG) | Avanti Polar Lipids | #840475 | lipid – in the form of extruded small unilamellar vesicles required for supported lipid bilayer formation |
dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (DOPS) | Avanti Polar Lipids | #840035 | lipid – in the form of extruded small unilamellar vesicles required for supported lipid bilayer formation |
double-sided tape | tesa | #57912-00000-02 | needed for the assembly of glass sample chambers |
Extruder | Avanti Polar Lipids | #610023 | Lipid extruder to enable monodisperse vesicle distributions |
EZ-Link Maleimide-PEG2-Biotin | Thermo Fisher Scientific | #A39261 | maileimide-fused biotin that can be used to biotinylate standard proteins for MSPT |
Fibronectin (Biotinylated) | Cytoskeleton Inc. | #FNR03-A | examplary protein that can be used as standard protein for MSPT |
Gel Filtration HMW Calibration Kit | Cytiva | #28403842 | standard proteins, e.g. aldolase that can be biotinylated and used as molecular weight standards for MSPT |
GM1 Ganglioside (Brain, Ovine-Sodium Salt) | Avanti Polar Lipids | #860065 | lipid – in the form of extruded small unilamellar vesicles required for supported lipid bilayer formation |
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Biotin | Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA) | #31820 | examplary protein to highlight the existence of different protein states |
Isopropanol, 99.5%, for spectroscopy | Thermo Fisher Scientific | #10003643 | |
Low Autofluorescence Immersion Oil | Olympus K.K. | #IMMOIL-F30CC | |
pET21a-Streptavidin-Alive | Addgene | #20860 | required to express and purify divalent streptavidin in combination with each other |
pET21a-Streptavidin-Dead | Addgene | #20859 | required to express and purify divalent streptavidin in combination with each other |
Pierce Alkaline Phosphatase, biotinylated | Thermo Fisher Scientific | #29339 | examplary protein that can be used as standard protein for MSPT |
Pierce Protein A, Biotinylated | Thermo Fisher Scientific | #29989 | examplary protein that can be used as standard protein for MSPT |
Refeyn Acquire | Refeyn Ltd. | control software for Refeyn OneMP | |
Refeyn One | Refeyn Ltd. | – | mass photometer |
sterile syringe filters 0.45 µm cellulose acetate membrane | VWR International | #514-0063 | needed to filter particles from the buffer of interest |
tetravalent streptavidin | Thermo Fisher Scientific | #SNN1001 | tetravalent streptavidin to enable the presence of several biotin binding sites |
Whatman Nuclepore Hydrophilic Membrane, 0.05 µm Pore Size, 25 mm Circle | Cytiva | #110603 | a pore size of 50 nm is recommended for supported lipid bilayer formation in the context of MSPT |
Zepto model 2 plasma cleaner | Diener electronic GmbH | – |