Avaliação de um Biomarcador Confiável em um Modelo de Sepse de Camundongo Induzido por Ligadura Cecal e Punção

Summary

Este protocolo apresenta os detalhes operatórios da ligadura e punção cecal (FLP) em um modelo de sepse em camundongo. O CLP é uma das técnicas mais utilizadas para criar um modelo animal de sepse. Portanto, um protocolo CLP padronizado é necessário para a obtenção de resultados de pesquisa confiáveis.

Abstract

A sepse é uma doença grave com risco de vida e em rápido desenvolvimento que causa milhões de mortes anualmente em todo o mundo. Os pesquisadores fizeram enormes esforços para elucidar a fisiopatologia da sepse usando vários modelos animais; o modelo de sepse induzida por ligadura e punção cecal (FLP) em camundongos é amplamente utilizado em laboratórios. Os três aspectos técnicos que afetam a gravidade e a replicabilidade do modelo de FLP são a porcentagem de ceco ligado, o tamanho da agulha utilizada para punção cecal e o volume de fezes espremidas na cavidade abdominal. O diagnóstico rápido e específico da sepse é um fator crucial que afeta o desfecho. O padrão-ouro para o diagnóstico de sepse é a cultura microbiana; no entanto, esse processo é demorado e às vezes impreciso. A detecção de biomarcadores específicos de sepse é rápida, mas os biomarcadores existentes são insatisfatórios devido a uma meia-vida curta, inespecificidade e sensibilidade insuficiente. Portanto, há uma necessidade urgente de um biomarcador confiável de sepse nos estágios iniciais. Publicações anteriores sugerem que armadilhas extracelulares (TNEs) excessivas de neutrófilos ocorrem na sepse. A histona H3 citrulinada (CitH3), como componente NET, está elevada tanto em animais sépticos quanto em pacientes, e a presença de CitH3 é um biomarcador diagnóstico confiável de sepse. O presente estudo teve como objetivo descrever um modelo padronizado de sepse induzida por FLP em camundongos e estabelecer um biomarcador sanguíneo confiável de sepse. Nosso trabalho pode contribuir para o diagnóstico precoce e preciso da sepse no futuro.

Introduction

A sepse é definida como disfunção de órgãos com risco de vida causada por uma resposta desregulada do hospedeiro à infecção¹, e o choque séptico é a principal causa de morte em casos graves de sepse². A sepse e o choque séptico causam milhões de mortes em todo o mundo a cada ano³. A chave para melhorar o desfecho de pacientes com sepse é o início imediato de tratamentos como antibióticos⁴. O método padrão-ouro para o diagnóstico de sepse é a cultura microbiana; no entanto, a cultura microbiana é demorada e pode levar a resultados falso-positivos e falso-negativos, o que limita sobremaneira a significância clínica⁵. Assim, é altamente desejável identificar um biomarcador sanguíneo de sepse. A procalcitonina é reconhecida como um biomarcador ideal de sepse, mas tem eficácia diagnóstica limitada por ser incapaz de distinguir sepse de doenças estéreis⁶.

A ligadura e punção cecal de camundongos (CLP) é comumente usada para criar um modelo de sepse em pesquisas científicas. A FLP é um dos modelos de sepse mais utilizados, pois mimetiza a peritonite polimicrobiana, ativando respostas imunes pró-inflamatórias e anti-inflamatórias⁷. É bem aceito que a FLP cria um modelo de sepse clinicamente mais relevante do que técnicas alternativas, como a injeção de endotoxina bacteriana. Portanto, a FLP é considerada o modelo clássico de sepse para uso em pesquisas⁸. No entanto, uma grande desvantagem da FLP é sua reprodutibilidade, pois a gravidade do modelo é afetada por vários fatores, como a porcentagem de ceco ligado, o tamanho da agulha, o número de punções e a técnica de laparotomia. Portanto, há necessidade de padronizar o modelo de sepse induzida por FLP. O presente estudo descreve os detalhes do protocolo do modelo de sepse induzida por FLP para mostrar o procedimento padronizado e aumentar sua reprodutibilidade.

A resposta inflamatória ocorre no estágio inicial da sepse, com neutrófilos liberando quantidades excessivas de oxidantes e proteases que causam danos aos órgãos⁸. Um fator-chave na fisiopatologia da sepse é a formação de armadilhas extracelulares de neutrófilos (TNEs), que liberam componentes nucleares e citosólicos, como DNA, histonas citrulinadas e proteinases antimicrobianas⁹. Estudos recentes sugerem que a geração excessiva de TNEs medeia a patologia da sepse; enquanto isso, uma diminuição dos TNEs, através da inibição enzimática da peptidil arginina deiminase (DAP) por substâncias químicas como YW3-56 ou Cl-amidina, exerce um efeito pró-sobrevivência em modelos de camundongos de sepse^10,11. A histona Citrulina H3 (CitH3) foi identificada como uma proteína específica da sepse em 2011¹², e publicações subsequentes demonstraram que a concentração circulante de CitH3 é um biomarcador diagnóstico confiável de sepse^13,14. O CitH3 é considerado um biomarcador mais sensível e duradouro que a procalcitonina, sendo mais específico na distinção entre sepse do que citocinas inflamatórias¹³.

Neste estudo, avaliamos um biomarcador diagnóstico confiável de sepse em um modelo de sepse induzido por FLP em camundongos.

Protocol

Todos os experimentos com animais foram realizados de acordo com as diretrizes aprovadas pelo Comitê de Revisão Animal do Hospital Xiangya e da Universidade Central do Sul (No. 202103149). 1. Preparação Selecione camundongos machos C57BL/6J (peso: 20-25 g; idade: 8-12 semanas) e hospede por 3 dias antes de realizar qualquer procedimento. Pese o mouse. Anestesiar o rato com isoflurano a 1,5% por inalação e beliscar os dedos dos pés para veri…

Representative Results

Como mostrado na Figura 2A, nenhum CitH3 foi detectado no grupo sham por western blotting. A concentração sérica de CitH3 aumentou significativamente após a FLP, e esse aumento foi bloqueado pela inibição da formação de NET através da administração de YW3-56, um inibidor de DAP10. A Figura 2B mostra as concentrações séricas de CitH3 determinadas por ELISA. Às 24 h após a FLP, a concentração sérica de CitH3 foi …

Discussion

A FLP introduz patógenos no abdômen para criar um modelo pré-clínico de sepse. Ao realizar a FLP, é importante utilizar condições estéreis para eliminar a interferência de bactérias exógenas e utilizar dosagens precisas de anestésicos¹⁶. Os três aspectos técnicos da FLP que afetam a gravidade e a replicabilidade do modelo de sepse são a porcentagem do ceco ligado, o tamanho da agulha usada para punção cecal e o volume de fezes espremidas na cavidade abdominal. A ligadura de aproxi…

Materials

21G needle
3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine	R&D Systems Inc	DY999
anti-CitH3 monoclonal antibody	laboratory self developed
anti-CitH3 polyclonal antibody	Abcam	ab5103
anti-rabbit secondary antibody	Jackson ImmunoResearch	111-035-003
C57BL/6 mice	Xiangya School of Medicine, Central South University
Cl-amidine	Sigma Aldrich	SML2250
depilatory cream
Dnase I	Sigma Aldrich	11284932001
isoflurane	Sigma-Aldrich	26675-46-7
ketoprofen	Sigma Aldrich	PHR1375
silk sutures (4-0 & 6-0)
surgical instruments
YW3-56	GLPBIO	GC48263