Dosisoptagelse af platin- og rutheniumbaseret sammensat eksponering i zebrafisk ved induktivt koblet plasmamassespektrometri med bredere anvendelser
Summary
Den øgede grad af farmako- og toksikokinetiske analyser af metaller og metalbaserede forbindelser i zebrafisk kan være en fordel for miljømæssige og kliniske oversættelsesundersøgelser. Begrænsningen af ukendt vandbåren eksponeringsoptagelse blev overvundet ved at udføre spormetalanalyse på fordøjet zebrafiskvæv ved hjælp af induktivt koblet plasmamassespektrometri.
Abstract
Metaller og metalbaserede forbindelser omfatter mangfoldige farmakoaktive og toksikologiske xenobiotika. Fra tungmetaltoksicitet til kemoterapeutika har toksikokinetikken af disse forbindelser både historisk og moderne relevans. Zebrafisk er blevet en attraktiv modelorganisme til at belyse farmako- og toksikokinetik i miljøeksponering og kliniske oversættelsesundersøgelser. Selvom zebrafiskestudier har den fordel, at de har højere gennemstrømning end gnavermodeller, er der flere væsentlige begrænsninger for modellen.
En sådan begrænsning er iboende i det vandbårne doseringsregime. Vandkoncentrationer fra disse undersøgelser kan ikke ekstrapoleres for at give pålidelige interne doser. Direkte målinger af de metalbaserede forbindelser giver mulighed for en bedre korrelation med forbindelsesrelaterede molekylære og biologiske reaktioner. For at overvinde denne begrænsning for metaller og metalbaserede forbindelser blev der udviklet en teknik til at fordøje zebrafisk larvevæv efter eksponering og kvantificere metalkoncentrationer i vævsprøver ved induktivt koblet plasmamassespektrometri (ICPMS).
ICPMS-metoder blev anvendt til at bestemme metalkoncentrationerne af platin (Pt) fra cisplatin og ruthenium (Ru) fra flere nye Ru-baserede kemoterapeutika i zebrafiskvæv. Derudover skelnede denne protokol koncentrationer af Pt, der blev sekvestreret i larvens korion sammenlignet med zebrafiskvævet. Disse resultater indikerer, at denne metode kan anvendes til at kvantificere den metaldosis, der er til stede i larvevæv. Endvidere kan denne metode justeres for at identificere specifikke metaller eller metalbaserede forbindelser i en bred vifte af eksponerings- og doseringsundersøgelser.
Introduction
Metaller og metalbaserede forbindelser har fortsat farmakologisk og toksikologisk relevans. Forekomsten af tungmetaleksponering og dens indvirkning på sundheden har eksponentielt øget den videnskabelige undersøgelse siden 1960’erne og nåede et all-time high i 2021. Koncentrationerne af tungmetaller i drikkevand, luftforurening og erhvervsmæssig eksponering overstiger lovgivningsmæssige grænser over hele verden og er fortsat et problem for arsen, cadmium, kviksølv, krom, bly og andre metaller. Nye metoder til at kvantificere miljøeksponering og analysere patologisk udvikling er fortsat i høj efterspørgsel 1,2,3.
Omvendt har det medicinske område udnyttet de fysiokemiske egenskaber af forskellige metaller til klinisk behandling. Metalbaserede lægemidler eller metallodrugs har en rig historie med medicinske formål og har vist aktivitet mod en række sygdomme, med den højeste succes som kemoterapeutika4. Den mest berømte af metallodrugs, cisplatin, er et Pt-baseret anticancerlægemiddel, der af Verdenssundhedsorganisationen (WHO) anses for at være et af verdens essentielle lægemidler5. I 2010 havde cisplatin og dets Pt-derivater op til en succesrate på 90% i flere kræftformer og blev anvendt i ca. 50% af kemoterapiregimerne 6,7,8. Selvom Pt-baserede kemoterapeutika har haft ubestridelig succes, har den dosisbegrænsende toksicitet sat gang i undersøgelser af alternative metalbaserede lægemidler med raffineret biologisk levering og aktivitet. Af disse alternativer er Ru-baserede forbindelser blevet de mest populære 9,10,11,12.
Der er behov for nye modeller og metoder for at holde trit med behovet for farmako- og toksikokinetiske metalundersøgelser. Zebrafiskmodellen ligger i krydsfeltet mellem kompleksitet og gennemstrømning, idet den er et hvirveldyr med høj fecundity med 70% bevaret genhomologi13. Denne model har været et aktiv inden for farmakologi og toksikologi med omfattende screeninger for forskellige forbindelser til blyopdagelse, målidentifikation og mekanistisk aktivitet 14,15,16,17. Imidlertid er screening af kemikalier med høj kapacitet typisk afhængig af vandbårne eksponeringer. I betragtning af at optagelsen kan variere baseret på de fysisk-kemiske egenskaber af forbindelsen i opløsning (dvs. fotonedbrydning, opløselighed), kan dette være en væsentlig begrænsning af korrelerende dosislevering og respons.
For at overvinde denne begrænsning til sammenligning af dosis med højere hvirveldyr blev en metode designet til at analysere spormetalkoncentrationer i zebrafisk larvevæv. Her blev dosis-responskurver for dødelige og subletale endepunkter evalueret for cisplatin og nye Ru-baserede anticancerforbindelser. Dødelighed og forsinket udklækning blev evalueret for nominelle koncentrationer på 0, 3,75, 7,5, 15, 30 og 60 mg/l cisplatin. Pt-akkumulering i organismevæv blev bestemt ved ICPMS-analyse, og organismens optagelse af respektive doser var 0,05, 8,7, 23,5, 59,9, 193,2 og 461,9 ng (Pt) pr. organisme. Derudover blev zebrafisklarver udsat for 0, 3,1, 6,2, 9,2, 12,4 mg/l PMC79. Disse koncentrationer blev analytisk bestemt til at indeholde 0, 0,17, 0,44, 0,66 og 0,76 mg/l Ru. Denne protokol gjorde det også muligt at skelne mellem koncentrationer af Pt sekvestreret i larvernes kor sammenlignet med zebrafiskvævet. Denne metode var i stand til at tilvejebringe pålidelige, robuste data til sammenligninger af farmako- og toksikokinetisk aktivitet mellem en veletableret kemoterapeutisk og en ny forbindelse. Denne metode kan anvendes på en bred vifte af metaller og metalbaserede forbindelser.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokollen beskrevet her er blevet implementeret for at bestemme levering og optagelse af metalbaserede kræftlægemidler, der indeholder enten Pt eller Ru. Selv om disse metoder allerede er blevet offentliggjort, diskuterer denne protokol vigtige overvejelser og detaljer for at tilpasse denne metode til en række forbindelser. OECD-protokollen kombineret med vævsfordøjelse og ICPMS-analyse tillod os at bestemme, at PMC79 var mere potent end cisplatin og resulterede i forskellig vævsakkumulering, hvilket tyder på se…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Finansiering: NJAES-Rutgers NJ01201, NIEHS Training Grant T32-ES 007148, NIH-NIEHS P30 ES005022. Derudover støttes Brittany Karas af uddannelsestilskud T32NS115700 fra NINDS, NIH. Forfatterne anerkender Andreia Valente og det portugisiske fundament for videnskab og teknologi (Fundação para a Ciência e Tecnologia, FCT; PTDC/QUI-QIN/28662/2017) til levering af PMC79.
Materials
| AB Strain Zebrafish (Danio reri) | Zebrafish International Resource Center | Wild-Type AB | Wild-Type AB Zebrafish |
| ACS Grade Nitric Acid | VWR BDH Chemicals | BDH3130-2.5LP | Nitric Acid (68-70%); used to make 10% HNO3 acid-bath solution for soaking/pre-celaning centrifuge tubes |
| Aquatox Fish Diet (Flake) | Zeigler Bros, Inc. | Flake food to be mixed in a 1:4 ratio of Aquatox Fish Diet to TetraMin Tropical Flakes and used as feed | |
| Artemia cysts, brine shrimp | PentairAES | BS90 | Brine shrimp eggs sold in 15-ozz, vacuum-packed cans to be hatched and used as feed |
| ASX-510 Autosampler for ICPMS | Teledyne CETAC | Automatic sampler with conifgurable XYZ movement, flowing rinse station, and 0.3 mm inner dimension probe. Compatible with Nu AttoLab software for programmable batch analyses. | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | CL 2 | Thermo Scientific CL 2 compact benchtop centrifuge with variable speed range up to 5200 rpm; used to bring sample and acid condensate to the bottom of the centrifuge tube bewteen microwave digestion intervals; aids in sample retention |
| Centrifuge tubes | VWR | 21008-105 | Ultra high performance polypropylene centrifuge tubes with flat cap; 15 mL volume; leak-proof with conical bottom |
| Class A Clear Glass Threaded Vials | Fisherbrand | 03-339-25B | Individual glass vials for exposure containment |
| Dimethyl Sulfoxide | Millipore Sigma | D8418 | Solvent or vehicle for hydrophobic compounds |
| Fixed Speed Vortex Mixer | VWR | 10153-834 | Vortex mixer; used to homogenize sample after acid digestion and dilution |
| High Purity Hydrogen Peroxide | Merk KGaA, EDM Millipore | 1.07298.0250 | Suprapur Hydrogen peroxide (30%); used for sample digestion |
| High Purity Nitric Acid | EDM Millipore | NX0408-2 | Omni Trace Ultra Nitric Acid (69%); used for sample digestion |
| Instant Ocean Sea Salt | Spectrum Brands, Inc. | Instant Ocean® Sea Salt | Egg water solution contains instand ocean sea salt with a final concentration of 60 µg/ml |
| Mars X Microwave Digestion System | CEM, Matthews, NC | Microwave acid digestion system used to digest and homogenize samples under uniform conditions. For this methodology the open vessel digestion method was completed using single-use polypropylene centrifuge tubes at low power (300 W). | |
| Multi-element Solution 3 | SPEX CertiPREP | CLMS-3 | Contains 10 mg/L Au, Hf, Ir, Pd, Pt, Fu, Sb, Sr, Te, Sn in 10% HCl/1% HNO3; used as a quality control standard for Pt and Ru analyses |
| Nu Instruments AttoM High Resolution Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometer (HR-ICP-MS) | Nu Instruments/Amatek | Double focussing magnetic sector inductively coupled plasma mass spectrometer with flexible low to high resolution slit system, and dynamic range detector system. Data processing and quantification is done using NuQuant companion software. | |
| Platinum (Pt) standard solution, NIST 3140 | National Institute of Standards and Technology | 3140 | Prepared from ampoule containing 9.996 mg/g Pt in 10% HCl; ; used as a quality control standard for Pt analyses |
| Platinum (Pt) standard solution, single-element | High Purity Standards | 100040-2 | Contains 1000 mg/L Pt in 5% HCl |
| Ruthenium (Ru) standard solution, single-element | High Purity Standards | 100046-2 | Contains 1000 mg/L Ru in 2% HCl |
| TetraMin Tropical Flakes | Tetra | 77101 | Flake food to be mixed in a 1:4 ratio of Aquatox Fish Diet to TetraMin Tropical Flakes and used as feed |
| Trace Metal Grade Nitric Acid | VWR BDH Chemicals | 87003-261 | Aristar Plus Nitric Acid (67-70%); used for rinse solution in ASX-510 Autosampler |
| Ultrasonic water bath | VWR | B2500A-DTH | Ultrasonic water bath used to aid in acid digestion prior to microwave digestion |
Riferimenti
- Rehman, K., Fatima, F., Waheed, I., Akash, M. S. H. Prevalence of exposure of heavy metals and their impact on health consequences. Journal of Cellular Biochemistry. 119 (1), 157-184 (2018).
- Anyanwu, B. O., Ezejiofor, A. N., Igweze, Z. N., Orisakwe, O. E. Heavy metal mixture exposure and effects in developing nations: an update. Toxics. 6 (4), 65 (2018).
- Doherty, C. L., Buckley, B. T. Translating analytical techniques in geochemistry to environmental health. Molecules. 26 (9), 2821 (2021).
- Boros, E., Dyson, P. J., Gasser, G. Classification of metal-based drugs according to their mechanisms of action. Chem. 6 (1), 41-60 (2020).
- Robertson, J., Barr, R., Shulman, L. N., Forte, G. B., Magrini, N. Essential medicines for cancer: WHO recommendations and national priorities. Bulletin of the World Health Organization. 94 (10), 735-742 (2016).
- Wheate, N. J., Walker, S., Craig, G. E., Oun, R. The status of platinum anticancer drugs in the clinic and in clinical trials. Dalton Transactions. 39 (35), 8113-8127 (2010).
- Brown, A., Kumar, S., Tchounwou, P. B. Cisplatin-based chemotherapy of human cancers. Journal of Cancer Science & Therapy. 11 (4), 97 (2019).
- Ghosh, S. Cisplatin: The first metal based anticancer drug. Bioorganic Chem. 88, 102925 (2019).
- Abid, M., Shamsi, F., Azam, A. Ruthenium complexes: an emerging ground to the development of metallopharmaceuticals for cancer therapy. Mini Reviews in Medicinal Chemistry. 16 (10), 772-786 (2016).
- Alessio, E., Messori, L. NAMI-A and KP1019/1339, two iconic ruthenium anticancer drug candidates face-to-face: a case story in medicinal inorganic chemistry. Molecules. 24 (10), 1995 (2019).
- Alessio, E., Mestroni, G., Bergamo, A., Sava, G. Ruthenium antimetastatic agents. Current Topics in Medicinal Chemistry. 4 (15), 1525-1535 (2004).
- Lin, K., Zhao, Z. -. Z., Bo, H. -. B., Hao, X. -. J., Wang, J. -. Q. Applications of ruthenium complex in tumor diagnosis and therapy. Frontiers in Pharmacology. 9, 1323 (2018).
- Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
- Wiley, D. S., Redfield, S. E., Zon, L. I. Chemical screening in zebrafish for novel biological and therapeutic discovery. Methods in Cell Biology. 138, 651-679 (2017).
- Bambino, K., Chu, J. Zebrafish in toxicology and environmental health. Current Topics in Developmental Biology. 124, 331-367 (2017).
- Rubinstein, A. L. Zebrafish assays for drug toxicity screening. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 2 (2), 231-240 (2006).
- Cassar, S., et al. Use of zebrafish in drug discovery toxicology. Chemical Research in Toxicology. 33 (1), 95-118 (2020).
- Westerfield, M. . The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). 4th edition. , (2000).
- Material safety data sheet: cisplatin injection). Pfizer Available from: https://cdn.pfizer.com/pfizercom/products/material_safety_data/PZ01470.pdf (2011)
- Nasiadka, A., Clark, M. D. Zebrafish breeding in the laboratory environment. ILAR Journal. 53 (2), 161-168 (2012).
- OECD. Test No. 236: Fish embryo acute toxicity (FET) test. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals Available from: https://www.oecd-ilibrary.org/environment/test-no-236-fish-embryo-acute-toxicity-fet-test_9789264203709-en (2013)
- EMD Millipore Corporation. Material Safety Data Sheet: OmniTrace Nitric Acid. EMD Millipore Corporation. , (2013).
- Safety data sheet: Hydrogen peroxide 30% Suprapur. EMD Millipore Corporation Available from: https://www.merckmillipore.com/IN/en/product/Hydrogen-peroxide-300-0 (2014)
- Karas, B. F., et al. A novel screening method for transition metal-based anticancer compounds using zebrafish embryo-larval assay and inductively coupled plasma-mass spectrometry analysis. Journal of Applied Toxicology. 39 (8), 1173-1180 (2019).
- Henn, K., Braunbeck, T. Dechorionation as a tool to improve the fish embryo toxicity test (FET) with the zebrafish (Danio rerio). Comparative Biochemistry and Physiology. Toxicology & Pharmacology: CBP. 153 (1), 91-98 (2011).
- Mandrell, D., et al. Automated zebrafish chorion removal and single embryo placement: optimizing throughput of zebrafish developmental toxicity screens. Journal of Laboratory Automation. 17 (1), 66-74 (2012).
- Karas, B. F., Hotz, J. M., Buckley, B. T., Cooper, K. R. Cisplatin alkylating activity in zebrafish causes resistance to chorionic degradation and inhibition of osteogenesis. Aquatic Toxicology. 229, 105656 (2020).
