제브라피쉬에서 백금 및 루테늄 기반 화합물 노출의 선량 흡수는 유도적으로 결합된 플라즈마 질량 분광법과 광범위한 응용 분야에 의한 것입니다.
Summary
제브라피쉬에서 금속 및 금속 기반 화합물의 약리학 및 독성 분석의 증가된 속도는 환경 및 임상 번역 연구에 유리할 수 있다. 알려지지 않은 수인성 노출 흡수의 한계는 유도 결합 플라즈마 질량 분광법을 사용하여 소화 된 제브라 피쉬 조직에 대한 미량 금속 분석을 수행함으로써 극복되었습니다.
Abstract
금속 및 금속-기반 화합물은 다방면의 약리-활성 및 독성학적 이종생물제를 포함한다. 중금속 독성에서 화학 요법에 이르기까지,이 화합물의 독성 학은 역사적, 현대적 관련성을 모두 가지고 있습니다. Zebrafish는 환경 노출 및 임상 번역 연구에서 약물 및 독성 학을 밝히는 데 매력적인 모델 유기체가되었습니다. 제브라 피쉬 연구는 설치류 모델보다 처리량이 높다는 이점이 있지만 모델에 몇 가지 중요한 제약 조건이 있습니다.
그러한 제한 중 하나는 수인성 투약 요법에 내재되어 있습니다. 이러한 연구의 물 농도는 신뢰할 수있는 내부 복용량을 제공하기 위해 외삽 될 수 없습니다. 금속계 화합물의 직접 측정은 화합물 관련 분자 및 생물학적 반응과의 더 나은 상관관계를 허용한다. 금속 및 금속 기반 화합물에 대한 이러한 한계를 극복하기 위해 노출 후 제브라피쉬 유충 조직을 소화하고 유도 결합 플라즈마 질량 분광법 (ICPMS)을 통해 조직 샘플 내의 금속 농도를 정량화하는 기술이 개발되었습니다.
ICPMS 방법은 제브라피쉬 조직에서 몇몇 신규한 Ru-기반 화학요법제로부터 시스플라틴 및 루테늄(Ru)으로부터의 백금(Pt)의 금속 농도를 결정하기 위해 사용되었다. 또한,이 프로토콜은 제브라 피쉬 조직과 비교하여 애벌레의 chorion에서 격리 된 Pt의 농도를 구별했습니다. 이들 결과는 이 방법이 애벌레 조직에 존재하는 금속 용량을 정량화하기 위해 적용될 수 있음을 나타낸다. 또한, 이 방법은 광범위한 노광 및 투약 연구에서 특정 금속 또는 금속계 화합물을 동정하도록 조정될 수 있다.
Introduction
금속 및 금속계 화합물은 약리학적 및 독성학적 관련성을 계속 갖는다. 중금속 노출의 유병률과 건강에 미치는 영향은 1960 년대 이후 과학적 조사를 기하 급수적으로 증가 시켰으며 2021 년에는 사상 최고치에 도달했습니다. 식수, 대기 오염 및 직업적 노출에서 중금속의 농도는 전 세계적으로 규제 한계를 초과하며 비소, 카드뮴, 수은, 크롬, 납 및 기타 금속의 문제로 남아 있습니다. 환경 노출을 정량화하고 병리학 적 발달을 분석하는 새로운 방법은 계속해서 높은 수요에 있습니다 1,2,3.
반대로, 의료 분야는 임상 치료를 위해 다양한 금속의 물리 화학적 특성을 활용했습니다. 금속 기반 약물 또는 메탈로 약물은 의약 목적의 풍부한 역사를 가지고 있으며 화학 요법으로 가장 높은 성공을 거둔 다양한 질병에 대한 활성을 보여주었습니다4. 메탈로제들 중 가장 유명한 시스플라틴은 세계보건기구(WHO)가 세계 필수의약품 중 하나로 간주하는 Pt 기반 항암제이다5. 2010년, 시스플라틴 및 이의 Pt 유도체는 여러 암에서 최대 90%의 성공률을 보였으며 화학요법요법 6,7,8의 약 50%에 사용되었다. Pt 기반 화학 요법은 반박 할 수없는 성공을 거두었지만 용량 제한 독성은 세련된 생물학적 전달 및 활성을 가진 대체 금속 기반 약물에 대한 조사를 시작했습니다. 이러한 대안 중 Ru계 화합물이 가장 많이 사용되는9,10,11,12가되었습니다.
새로운 모델과 방법론은 금속 약리학 및 독성 학적 연구에 대한 필요성의 비율에 보조를 맞추기 위해 필요합니다. 제브라피쉬 모델은 복잡성과 처리량의 교차점에 있으며, 70% 보존된 유전자 상동성을 갖는 높은 출산율 척추동물이다(13). 이 모델은 약리학 및 독성학의 자산이었으며 납 발견, 표적 식별 및 기계론적 활동을위한 다양한 화합물에 대한 광범위한 스크리닝14,15,16,17. 그러나 화학 물질의 고처리량 스크리닝은 일반적으로 수인성 노출에 의존합니다. 흡수가 용액 중의 화합물의 물리화학적 특성(즉, 광분해, 용해도)에 기초하여 가변적일 수 있다는 것을 감안할 때, 이것은 용량 전달 및 반응과 상관관계가 있는 주요 한계가 될 수 있다.
더 높은 척추 동물에 대한 복용량의 비교를위한 이러한 한계를 극복하기 위해, 방법론은 제브라 피쉬 애벌레 조직에서 미량 금속 농도를 분석하도록 설계되었습니다. 여기서, 치사 및 치사하 종말점의 용량-반응 곡선을 시스플라틴 및 신규한 Ru계 항암 화합물에 대해 평가하였다. 치사율 및 지연된 부화는 0, 3.75, 7.5, 15, 30 및 60 mg/L 시스플라틴의 공칭 농도에 대해 평가되었다. 유기체 조직에서의 Pt 축적은 ICPMS 분석에 의해 결정되었고, 각각의 투여량의 유기체 흡수는 유기체 당 0.05, 8.7, 23.5, 59.9, 193.2, 및 461.9 ng (Pt)이었다. 또한, 제브라 피쉬 유충은 PMC79의 0, 3.1, 6.2, 9.2, 12.4 mg / L에 노출되었습니다. 이 농도는 분석적으로 0, 0.17, 0.44, 0.66 및 0.76 mg / L의 Ru를 포함하는 것으로 결정되었습니다. 이 프로토콜은 또한 제브라 피쉬 조직과 비교하여 유충의 chorion에서 격리 된 Pt의 농도를 구별 할 수있었습니다. 이 방법론은 잘 확립 된 화학 요법과 새로운 화합물 사이의 약물 및 독성 학적 활성의 비교를위한 신뢰할 수 있고 강력한 데이터를 제공 할 수있었습니다. 이 방법은 광범위한 금속 및 금속계 화합물에 적용될 수 있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에 설명된 프로토콜은 Pt 또는 Ru를 함유하는 금속계 항암제의 전달 및 흡수를 결정하기 위해 구현되었다. 이러한 방법은 이미 발표되었지만이 프로토콜은 다양한 화합물에 대해이 방법론을 적용하기위한 중요한 고려 사항 및 세부 사항을 논의합니다. 조직 소화 및 ICPMS 분석과 결합 된 OECD 프로토콜은 PMC79가 시스 플라틴보다 더 강력하다는 것을 결정할 수있게 해주었고 이질적인 조직 축적을 …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
펀딩: NJAES-Rutgers NJ01201, NIEHS 트레이닝 그랜트 T32-ES 007148, NIH-NIEHS P30 ES005022. 또한 브리트니 카라스는 NINDS, NIH의 교육 보조금 T32NS115700에 의해 지원됩니다. 저자는 Andreia Valente와 포르투갈 과학 기술 재단 (Fundação para a Ciência e Tecnologia, FCT; PTDC/QUI-QIN/28662/2017) PMC79 공급용.
Materials
| AB Strain Zebrafish (Danio reri) | Zebrafish International Resource Center | Wild-Type AB | Wild-Type AB Zebrafish |
| ACS Grade Nitric Acid | VWR BDH Chemicals | BDH3130-2.5LP | Nitric Acid (68-70%); used to make 10% HNO3 acid-bath solution for soaking/pre-celaning centrifuge tubes |
| Aquatox Fish Diet (Flake) | Zeigler Bros, Inc. | Flake food to be mixed in a 1:4 ratio of Aquatox Fish Diet to TetraMin Tropical Flakes and used as feed | |
| Artemia cysts, brine shrimp | PentairAES | BS90 | Brine shrimp eggs sold in 15-ozz, vacuum-packed cans to be hatched and used as feed |
| ASX-510 Autosampler for ICPMS | Teledyne CETAC | Automatic sampler with conifgurable XYZ movement, flowing rinse station, and 0.3 mm inner dimension probe. Compatible with Nu AttoLab software for programmable batch analyses. | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | CL 2 | Thermo Scientific CL 2 compact benchtop centrifuge with variable speed range up to 5200 rpm; used to bring sample and acid condensate to the bottom of the centrifuge tube bewteen microwave digestion intervals; aids in sample retention |
| Centrifuge tubes | VWR | 21008-105 | Ultra high performance polypropylene centrifuge tubes with flat cap; 15 mL volume; leak-proof with conical bottom |
| Class A Clear Glass Threaded Vials | Fisherbrand | 03-339-25B | Individual glass vials for exposure containment |
| Dimethyl Sulfoxide | Millipore Sigma | D8418 | Solvent or vehicle for hydrophobic compounds |
| Fixed Speed Vortex Mixer | VWR | 10153-834 | Vortex mixer; used to homogenize sample after acid digestion and dilution |
| High Purity Hydrogen Peroxide | Merk KGaA, EDM Millipore | 1.07298.0250 | Suprapur Hydrogen peroxide (30%); used for sample digestion |
| High Purity Nitric Acid | EDM Millipore | NX0408-2 | Omni Trace Ultra Nitric Acid (69%); used for sample digestion |
| Instant Ocean Sea Salt | Spectrum Brands, Inc. | Instant Ocean® Sea Salt | Egg water solution contains instand ocean sea salt with a final concentration of 60 µg/ml |
| Mars X Microwave Digestion System | CEM, Matthews, NC | Microwave acid digestion system used to digest and homogenize samples under uniform conditions. For this methodology the open vessel digestion method was completed using single-use polypropylene centrifuge tubes at low power (300 W). | |
| Multi-element Solution 3 | SPEX CertiPREP | CLMS-3 | Contains 10 mg/L Au, Hf, Ir, Pd, Pt, Fu, Sb, Sr, Te, Sn in 10% HCl/1% HNO3; used as a quality control standard for Pt and Ru analyses |
| Nu Instruments AttoM High Resolution Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometer (HR-ICP-MS) | Nu Instruments/Amatek | Double focussing magnetic sector inductively coupled plasma mass spectrometer with flexible low to high resolution slit system, and dynamic range detector system. Data processing and quantification is done using NuQuant companion software. | |
| Platinum (Pt) standard solution, NIST 3140 | National Institute of Standards and Technology | 3140 | Prepared from ampoule containing 9.996 mg/g Pt in 10% HCl; ; used as a quality control standard for Pt analyses |
| Platinum (Pt) standard solution, single-element | High Purity Standards | 100040-2 | Contains 1000 mg/L Pt in 5% HCl |
| Ruthenium (Ru) standard solution, single-element | High Purity Standards | 100046-2 | Contains 1000 mg/L Ru in 2% HCl |
| TetraMin Tropical Flakes | Tetra | 77101 | Flake food to be mixed in a 1:4 ratio of Aquatox Fish Diet to TetraMin Tropical Flakes and used as feed |
| Trace Metal Grade Nitric Acid | VWR BDH Chemicals | 87003-261 | Aristar Plus Nitric Acid (67-70%); used for rinse solution in ASX-510 Autosampler |
| Ultrasonic water bath | VWR | B2500A-DTH | Ultrasonic water bath used to aid in acid digestion prior to microwave digestion |
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