Zebrafish Corneal Wound Healing: dall'abrasione all'analisi di imaging della chiusura della ferita

Summary

Questo protocollo si concentra sul danneggiamento della superficie oculare del pesce zebra attraverso l’abrasione per valutare la successiva chiusura della ferita a livello cellulare. Questo approccio sfrutta una bava oculare per rimuovere parzialmente l’epitelio corneale e utilizza la microscopia elettronica a scansione per tracciare i cambiamenti nella morfologia cellulare durante la chiusura della ferita.

Abstract

Come la superficie trasparente dell’occhio, la cornea è strumentale per la visione chiara. A causa della sua posizione, questo tessuto è soggetto a insulti ambientali. In effetti, le lesioni oculari più frequentemente riscontrate clinicamente sono quelle alla cornea. Mentre la guarigione delle ferite corneali è stata ampiamente studiata nei piccoli mammiferi (cioè topi, ratti e conigli), gli studi di fisiologia corneale hanno trascurato altre specie, incluso il pesce zebra, nonostante il pesce zebra sia un classico modello di ricerca.

Questo rapporto descrive un metodo per eseguire un’abrasione corneale sul pesce zebra. La ferita viene eseguita in vivo su pesci anestetizzati utilizzando una bava oculare. Questo metodo consente una ferita epiteliale riproducibile, lasciando intatto il resto dell’occhio. Dopo l’abrasione, la chiusura della ferita viene monitorata nel corso di 3 ore, dopo di che la ferita viene rielettileializzata. Utilizzando la microscopia elettronica a scansione, seguita dall’elaborazione delle immagini, la forma della cellula epiteliale e le protrusioni apicali possono essere studiate per studiare i vari passaggi durante la chiusura della ferita epiteliale corneale.

Le caratteristiche del modello zebrafish consentono lo studio della fisiologia del tessuto epiteliale e del comportamento collettivo delle cellule epiteliali quando il tessuto viene sfidato. Inoltre, l’uso di un modello privato dell’influenza del film lacrimale può produrre nuove risposte per quanto riguarda la risposta corneale allo stress. Infine, questo modello permette anche la delineazione degli eventi cellulari e molecolari coinvolti in qualsiasi tessuto epiteliale sottoposto ad una ferita fisica. Questo metodo può essere applicato alla valutazione dell’efficacia del farmaco nei test preclinici.

Introduction

Poiché la maggior parte degli epiteli sono a contatto con l’ambiente esterno, sono soggetti a lesioni fisiche, rendendoli adatti per lo studio dei processi di guarigione delle ferite. Tra i tessuti ben studiati, la cornea è un modello estremamente utile nello studio degli aspetti cellulari e molecolari della guarigione delle ferite. Come superficie esterna trasparente, fornisce protezione fisica all’occhio ed è il primo elemento a focalizzare la luce sulla retina. Mentre la struttura e la composizione cellulare della retina differiscono tra la specie¹, questi elementi della cornea sono generalmente simili in tutti gli occhi di tipo camera, indipendentemente dalla specie.

La cornea è composta da tre strati principali². Il primo e più esterno strato è l’epitelio, che viene costantemente rinnovato per garantirne la trasparenza. Il secondo strato è lo stroma, che contiene cellule sparse, chiamate cheratociti, all’interno di uno spesso strato di fibre di collagene rigorosamente organizzate. Il terzo e più interno strato è l’endotelio, che consente la diffusione di nutrienti e liquidi dalla camera anteriore agli strati esterni. Le cellule epiteliali e stromali interagiscono attraverso fattori di crescita e citochine³. Questa interazione è evidenziata dalla rapida apoptosi e dalla successiva proliferazione dei cheratociti dopo danno epiteliale ^4,5. In caso di una ferita più profonda, come una puntura, i cheratociti prendono parte attiva al processo di guarigione⁶.

Essendo a contatto con l’ambiente esterno, le lesioni fisiche corneali sono comuni. Molti di loro sono causati da piccoli oggetti estranei⁷, come sabbia o polvere. Il riflesso dello sfregamento degli occhi può portare a estese abrasioni epiteliali e rimodellamento corneale⁸. Secondo le dimensioni e la profondità della ferita, queste lesioni fisiche sono dolorose e richiedono diversi giorni per guarire⁹. Le caratteristiche ottimali di guarigione delle ferite di un modello facilitano la comprensione degli aspetti cellulari e molecolari della chiusura della ferita. Inoltre, tali modelli si sono dimostrati utili anche per testare nuove molecole con il potenziale di accelerare la guarigione corneale, come precedentemente dimostrato^10,11.

Il protocollo qui descritto mira a utilizzare il pesce zebra come modello rilevante per studiare le lesioni fisiche corneali. Questo modello è molto conveniente per gli studi di screening farmacologico in quanto consente di aggiungere molecole direttamente all’acqua del serbatoio e, quindi, di entrare in contatto con una cornea curativa. I dettagli forniti qui aiuteranno gli scienziati a eseguire i loro studi sul modello di zebrafish. La lesione in vivo viene eseguita con una bava oculare opaca. L’impatto sulle cellule epiteliali adiacenti o a distanza da esso può essere analizzato rimuovendo specificamente l’epitelio corneale centrale. Negli ultimi anni, numerosi rapporti si sono concentrati su tale metodo sulla cornea dei roditori 12,13,14,15,16,17; tuttavia, ad oggi, solo un singolo rapporto ha applicato questo metodo al pesce zebra¹⁸.

A causa della sua semplicità, la ferita fisica è utile per delineare il ruolo delle cellule epiteliali nella chiusura della ferita. Un altro modello ben consolidato di danno corneale è l’ustione chimica, in particolare l’ustione alcalina 19,20,21. Tuttavia, un tale approccio danneggia indirettamente l’intera superficie oculare, compresa la cornea periferica e lo stroma corneale¹⁹. In effetti, le ustioni alcaline potenzialmente inducono ulcere corneali, perforazioni, opacizzazione epiteliale e rapida neovascolarizzazione²², e l’esito incontrollabile delle ustioni alcaline squalifica tale approccio per gli studi generali di guarigione delle ferite. Numerosi altri metodi sono utilizzati anche per studiare la guarigione delle ferite corneali secondo il particolare focus dello studio in questione (ad esempio, debridement epiteliale completo²³, la combinazione di lesioni chimiche e meccaniche per ferite a spessore parziale²⁴, ablazione laser ad eccimeri per ferite che si estendono allo stroma²⁵). L’uso di una bava oculare limita il punto focale alla risposta epiteliale alla ferita e fornisce una ferita altamente riproducibile.

Come con ogni metodo di inflizione della ferita, l’uso di una bava oculare presenta vantaggi e svantaggi. Lo svantaggio principale è che la risposta essendo per lo più epiteliale, non riflette perfettamente le abrasioni osservate in ambito clinico. Tuttavia, questo metodo presenta numerosi vantaggi, tra cui la facilità con cui può essere impostato ed eseguito, la sua precisione, la sua riproducibilità e il fatto che non sia invasivo, rendendolo un metodo ben tollerato dagli animali.

Protocol

Tutti gli esperimenti sono stati approvati dal consiglio nazionale per gli esperimenti sugli animali. 1. Preparativi Preparare in anticipo la soluzione madre di tricaina utilizzata per l’anestesia26 (soluzione madre allo 0,4% utilizzata in questo protocollo). Utilizzare guanti e tenere i materiali in una cappa aspirante quando possibile. Per 50 ml di una soluzione allo 0,4%, pesare 200 mg di polvere di tricaina in un tubo da 50 ml. Sci…

Representative Results

Questo studio descrive un metodo che utilizza una bava oftalmica in esperimenti di guarigione delle ferite corneali zebrafish. Il metodo è stato modificato da studi precedenti sui topi, dove la bava ha dimostrato di rimuovere gli strati cellulari epiteliali in modo efficiente13. Le sfide nel ferimento corneale del pesce zebra includono le dimensioni relativamente piccole dell’occhio e, nel caso di esperimenti che richiedono tempo, la necessità di mantenere un flusso d’acqua costante attraverso l…

Discussion

Le lesioni fisiche corneali sono la causa più comune di visite dei pazienti oftalmologici in ospedale. Pertanto, è importante stabilire modelli pertinenti per lo studio di diversi aspetti della fisiopatologia corneale. Finora, il topo è il modello più comunemente usato per lo studio della guarigione delle ferite corneali. Tuttavia, l’aggiunta di colliri sugli occhi feriti murini per convalidare l’impatto di farmaci specifici sulla guarigione delle ferite corneali può essere difficile. A questo proposito, il modello …

Materials

0.1M Na-PO4 (sodium phosphate buffer), pH 7.4	in-house		Solution is prepared from 1M sodium phosphate buffer (1M Na2HPO4 adjusted to pH 7.4 with 1M NaH2PO4).
0.2M Na-PO4 (sodium phosphate buffer), pH 7.4	in-house		Solution is prepared from 1M sodium phosphate buffer (1M Na2HPO4 adjusted to pH 7.4 with 1M NaH2PO4).
0.5mm burr tips	Alger Equipment Company	BU-5S
1M Tris, pH 8.8	in-house
adhesive tabs	Agar Scientific	G3347N
Algerbrush burr, Complete instrument	Alger Equipment Company	BR2-5
Cotton swaps	Heinz Herenz Hamburg	1030128
Dissecting plate	in-house
Dissecting tools	Fine Science Tools
double-distilled water	in-house
Eppedorf tubes, 2ml	any provider
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt	Sigma	A5040	Caution: causes irritation.
Glutaraldehyde, 50% aqueous solution, grade I	Sigma	G7651	Caution: toxic.
Lidocaine hydrochloride	Sigma	L5647	Caution: toxic.
mounts	Agar Scientific	G301P
Petri dish	Thermo Scientific	101VR20
pH indicator strips	Macherey-Nagel	92110
Plastic spoons	any provider
Plastic tubes, 15 ml	Greiner Bio-One	188271
Plastic tubes, 50 ml	Greiner Bio-One	227261
Scanning electron microscope	FEI	Quanta 250 FEG
Soft sponge	any provider
Sputter coater	Quorum Technologies	GQ150TS
Stereomicroscope	Leica