Global niveau kvantificering af histon post-translationelle modifikationer i en 3D-cellekulturmodel af levervæv

Summary

Denne protokol skitserer, hvordan et tredimensionelt cellekultursystem kan bruges til at modellere, behandle og analysere kromatinmodifikationer i en næsten fysiologisk tilstand.

Abstract

Flade kulturer af pattedyrceller er en meget anvendt in vitro-tilgang til forståelse af cellefysiologi, men dette system er begrænset til modellering af fast væv på grund af unaturligt hurtig cellereplikation. Dette er især udfordrende ved modellering af modent kromatin, da hurtigt replikerende celler ofte er involveret i DNA-replikation og har en heterogen polyploid population. Præsenteret nedenfor er en arbejdsgang til modellering, behandling og analyse af quiescent kromatinmodifikationer ved hjælp af et tredimensionelt (3D) cellekultursystem. Ved hjælp af denne protokol dyrkes hepatocellulære carcinomcellelinjer som reproducerbare 3D-sfæroider i en inkubator, der giver aktiv næringsdiffusion og lave forskydningskræfter. Behandling med natriumsmoyrat og natriumsuccinat inducerede en stigning i henholdsvis histonacetylering og succinylering. Stigninger i niveauer af histonacetylering og succinylering er forbundet med en mere åben kromatintilstand. Sfæroider indsamles derefter til isolering af cellekerner, hvorfra histonproteiner ekstraheres til analyse af deres posttranslationelle modifikationer. Histonanalyse udføres via væskekromatografi kombineret online med tandemmassespektrometri efterfulgt af en intern beregningsrørledning. Endelig vises eksempler på datarepræsentation for at undersøge hyppigheden og forekomsten af kombinatoriske histonmærker.

Introduction

Siden slutningen af det 19^. århundrede er cellekultursystemer blevet brugt som model til at studere vækst og udvikling af celler uden for menneskekroppen ^1,2. Deres anvendelse er også blevet udvidet til at undersøge, hvordan væv og organer fungerer i både sunde og syge sammenhænge ^1,3. Suspensionsceller (f.eks. blodlegemer) vokser i petriskåle eller kolber problemfrit og i flæng, da de ikke samles i tredimensionelle (3D) strukturer in vivo. Celler afledt af faste organer kan vokse i enten todimensionelle (2D) eller 3D-kultursystemer. I 2D-kultur dyrkes celler i et monolag, der klæber til en flad overflade ^2,4. 2D-cellekultursystemer er kendetegnet ved eksponentiel vækst og en hurtig fordoblingstid, typisk 24 timer til et par dage⁵. Celler i 3D-systemer vokser til at danne indviklede celle-celle-interaktioner, der modellerer vævslignende konglomerater tættere, og de er kendetegnet ved deres evne til at nå en dynamisk ligevægt, hvor deres fordoblingstid kan nå 1 måned eller længere⁵.

Præsenteret i dette papir er en innovativ metode til at dyrke 3D-sfæroider i roterende cellekultursystemer, der simulerer reduceret tyngdekraft⁶. Dette er et forenklet derivat af et cellekultursystem introduceret af NASA i 1990’erne⁷. Denne fremgangsmåde minimerer forskydningskræfterne, som forekommer i eksisterende metoder som spindekolber, og øger sfæroidreproducerbarheden⁶. Derudover øger den roterende bioreaktor aktiv næringsdiffusion, hvilket minimerer nekrotisk dannelse, der forekommer i systemer som hængende dråbecellekultur, hvor medieudveksling er upraktisk⁶. På denne måde vokser cellerne for det meste uforstyrret, hvilket muliggør dannelse af strukturelle og fysiologiske egenskaber forbundet med celler, der vokser i væv. C3A-hepatocytter (HepG2 / C3A) dyrket på denne måde havde ikke kun ultrastrukturelle organeller, men producerede også mængder ATP, adenylatkinase, urinstof og kolesterol, der kunne sammenlignes med niveauer observeret in vivo ^1,2. Derudover udviser celler dyrket i 2D vs.3D cellekultursystemer forskellige genekspressionsmønstre⁸. Genekspressionsanalyse af C3A-hepatocytter dyrket som 3D-sfæroider viste, at disse celler udtrykte en bred vifte af leverspecifikke proteiner såvel som gener involveret i nøgleveje, der regulerer leverfunktion⁸. Tidligere publikationer viste forskellene mellem proteomer af eksponentielt voksende celler i 2D-kultur vs. celler ved dynamisk ligevægt i 3D-sfæroidkulturer⁵. Disse forskelle omfatter cellulær metabolisme, som igen påvirker strukturen, funktionen og fysiologien af cellen⁵. Proteomet af celler dyrket i 2D-kultur var mere beriget i proteiner involveret i cellereplikation, mens proteomet af 3D-sfæroider var mere beriget i leverfunktionalitet⁵.

Den langsommere replikationshastighed for celler, der dyrkes som 3D-sfæroider, modellerer mere præcist specifikke fænomener forbundet med kromatintilstand og modifikationer (f.eks.^{Histonklipning 9}). Histonklipning er en irreversibel histon post-translationel modifikation (PTM), der forårsager proteolytisk spaltning af en del af histon N-terminal halen. Mens dens biologiske funktion stadig diskuteres 10,11,12,13, er det klart, at dets tilstedeværelse i primære celler og levervæv er modelleret af HepG2 / C3A-celler dyrket som sfæroider, men ikke som flade celler 9. Dette er kritisk, da kromatintilstand og modifikationer regulerer DNA-udlæsning for det meste ved at modulere tilgængeligheden til gener og dermed deres^{ekspression 14}. Histon PTM’er påvirker enten kromatintilstanden direkte ved at påvirke nettoladningen af nukleosomerne, hvor histoner samles, eller indirekte ved at rekruttere kromatinforfattere, læsere og viskelædere¹⁴. Hundredvis af histon PTM’er er blevet identificeret til dato¹⁵, hvilket forstærker hypotesen om, at kromatin er vært for en “histonkode”, der bruges af cellen til at fortolke DNA¹⁶. Identifikationen af et utal af PTM-kombinationer¹⁵ og opdagelsen af, at kombinationer af histon-PTM’er ofte har forskellige biologiske funktioner fra PTM’er, der er til stede isoleret (f.eks. Fischle, et ^al.17), understreger imidlertid, at der kræves mere arbejde for at dekryptere “histonkoden”.

I øjeblikket er histon PTM-analyse enten baseret på teknikker, der anvender antistoffer (f.eks. Western blots, immunofluorescens eller kromatinimmunfældning efterfulgt af sekventering [ChIP-seq]) eller massespektrometri (MS). Antistofbaserede teknikker har høj følsomhed og kan give detaljerede oplysninger om den genom-brede lokalisering af histonmærker, men er ofte begrænset til at studere sjældne PTM’er eller PTM’er til stede i kombinationer 18,19,20. MS er mere velegnet til høj gennemstrømning og upartisk identifikation og kvantificering af enkelt- og sameksekserende proteinmodifikationer, navnlig histonproteiner 18,19,20. Af disse grunde har dette og flere andre laboratorier optimeret MS-rørledningen til analyse af histonpeptider (bottom-up MS), intakte histonhaler (mid-down MS) og histonproteiner i fuld længde (top-down MS)21,22,23.

Detaljeret nedenfor er en arbejdsgang til dyrkning af HepG2 / C3A-sfæroider og forberedelse af dem til histonpeptidanalyse (bottom-up MS) via nano-væskekromatografi kombineret online med tandemmassespektrometri (nLC-MS / MS). En 2D-cellekultur blev dyrket, og cellerne blev høstet og overført til en bioreaktor, hvor de ville begynde at danne sfæroider (figur 1). Efter 18 dage i kultur blev sfæroider behandlet med natriumsmolyrat eller natriumsuccinat for at øge de relative mængder histonacetylering og kortfattethed. Især kan 3D-kulturer behandles med genotoksiske forbindelser lige så godt som deres flade kulturækvivalenter; Faktisk fremhæver nylige publikationer, at toksikologiresponsen fra celler i 3D-kultur ligner mere primært væv end dem i 2D flad kultur^24,25. Celler blev derefter indsamlet på bestemte tidspunkter, og nuklear isolering blev udført. Derefter blev histoner ekstraheret og afledt med propionisk anhydrid før og efter trypsinfordøjelse i henhold til en protokol, der først blev udviklet af Garcia et ^al.26. Denne procedure genererer peptider af en passende størrelse til online adskillelse med omvendt fasekromatografi (C₁₈) og detektion med MS. Endelig blev histonpeptider identificeret og kvantificeret, og de genererede data blev repræsenteret på flere måder for en mere fuldstændig biologisk fortolkning.

Protocol

1. Fremstilling af buffere og reagenser Cellevækstmedier (for HepG2/C3A-celler): Tilsæt føtalt kvægserum (FBS) (10% v/v), ikke-essentielle aminosyrer (1% v/v), L-glutamintilskud (1% v/v) og penicillin/streptomycin (0,5% v/v) til Dulbeccos modificerede ørnemedium (DMEM, indeholdende 4,5 g/l glucose). Vækstmedier opbevares ved 4 °C i højst 2 uger. 200 mM natriumbutyrat (NaBut) opløsning: Til fremstilling af 10 ml skal du resuspend 220,18 mg NaBut i 10 mlddH20. Opbeva…

Representative Results

I denne protokol blev HepG2/C3A-sfæroider behandlet med 20 mM NaBut og 10 mM NaSuc, som begge påvirkede globale niveauer af histon-PTM’er (figur 3A). Histon PTM’er blev derefter identificeret og kvantificeret på niveauet for enkeltrestkoncentrationer via MS/MS-erhvervelse (figur 3B). Når prøver køres i replikater, kan statistisk analyse udføres for at vurdere foldændringsberigelsen af en PTM mellem prøver samt reprod…

Discussion

Analysen af histon PTM’er er fundamentalt forskellig fra den typiske proteomics-analysepipeline. De fleste histon PTM’er har stadig gådefulde biologiske funktioner; som følge heraf er kommentarer såsom gen ontologi eller pathway databaser ikke tilgængelige. Der findes flere ressourcer, der forbinder histonmodifikationer med enzymet, der er ansvarligt for deres katalyse eller proteiner, der indeholder domæner, der binder disse PTM’er (f.eks. HISTome³⁶). Det er også muligt at spekulere i kroma…

Materials

0.05% trypsin-EDTA solution	Gibco	25300054
0.5-20 µL pipet tips	BRAND	13-889-172 (Fisher Scientific)
1.5 mL microcentrifuge tubes	Bio-Rad	2239480
10 µL multi-channel pipette	BRAND	BR7059000 (Millipore Sigma)
10 mL syringe	Henke Sass Wolf	14-817-31 (Fisher Scientific)	Luer lock tip, graduated to 12 mL
10, 20, 200, and 1000 µL single-channel pipettes	Eppendorf	14-285-904 (Fisher Scientific)
1000 µL pipet tips	Rainin	30389164
18 G syringe needle	Air-Tite	14-817-100 (Fisher Scientific)	3" length, 0.05" diameter
200 µL multi-channel pipette	Corning	4082
2-200 µL pipet tips	BRAND	Z740118 (Millipore Sigma)
24-well ultra-low attachment microplate	Corning	07-200-602
75 cm2  U-shaped cell culture flask	Corning	461464U	Untreated, with vent cap
96-well skirted plate	Axygen	PCR-96-FS-C (Corning)
Acetone	Fisher Scientific	A949-1	Acetone should be used cold
Ammonium bicarbonate (NH4HCO3)	Sigma-Aldrich	A6141-25G
Ammonium hydroxide solution	Fisher Scientific	AC423300250
Cell culture grade water	Corning	25-055-CV
ClinoReactor	CelVivo	10004-12	Bioreactor for 3D cell culture
ClinoStar	CelVivo	N/A	Clinostat CO2 incubator for 3D cell culture
Control unit	CelVivo	N/A	Tablet for ClinoStar settings
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)	Corning	17-205-CV	1X solution with 4.5 g/L glucose and sodium pyruvate, without L-glutamine and phenol red
Fetal bovine serum (FBS)	Corning	35-010-CV
Formic acid	Thermo Scientific	28905
Fume hood	Mott	N/A	Model 7121000
Glass Pasteur pipette	Fisher Scientific	13-678-8B	9", cotton-plugged, borosilicate glass, non-sterile
Glutagro supplement	Corning	25-015-CI	200 mM L-ananyl-L-glutamine
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS)	Corning	21-022-CV	1X solution without calcium, magnesium, and phenol red
HPLC grade acetonitrile	Fisher Scientific	A955-4
HPLC grade water	Fisher Scientific	W6-1
Hydrochloric acid (HCl)	Fisher Scientific	A481-212
Ice	N/A	N/A
MEM non-essential amino acids	Corning	25-025-CI	100X solution
Oasis HLB resin	Waters	186007549	Hydrophilic-Lipophilic-Balanced (HLB) Resin with 30µm particle size
Orbitrap Fusion Lumos Tribrid mass spectrometer	Thermo Fisher Scientific	IQLAAEGAAPFADBMBHQ	High resolution mass spectrometer
Oro-Flex I polypropylene filter plate	Orochem	OF1100	96-well polypropylene filter plate w/ 10 µM PE frit
Penicillin-Streptomycin	Corning	30-002-CI	100X solution
pH paper	Hydrion	Z111848 (Sigma-Aldrich)	0-13 pH test paper
Pipette gun	Eppendorf	Z666467 (Millipore Sigma)
Polymicro capillary	Molex	50-110-7740 (Fisher Scientific)	Flexible fused silica capillary tubing with polymide coating, 75 µM ID x 363 µM OD
Polystyrene 10 mL serological pipets, sterile	Fisher Scientific	1367549
Propionic anhydride	Sigma-Aldrich	240311-50G
Refrigerated centrifuge	Thermo Scientific	75-217-420
Reprosil-Pur resin	MSWIL	R13.AQ.0003	120 Å pore size, C18-AQ phase, 3 µM bead size
Rotator	Clay Adams	25477 (American Laboratory Trading)	Nutator Mixer 1105
Sequencing grade modified trypsin	Promega	V5111
Sodium butyrate	Thermo Scientific	A11079
Sodium succinate dibasic	Sigma-Aldrich	14160-100G
SpeedVac vacuum concentrator (1.5 mL microcentrifuge tubes)	Savant	20249 (American Laboratory Trading)
SpeedVac vacuum concentrator (96-well)	Thermo Scientific	15308325	Savant SPD1010
Sterile hood	Thermo Scientific	1375	Class II, Type A2
Sulfuric acid (H2SO4)	Fisher Scientific	02-004-375	Baker Analyzed ACS reagent
Tissue-culture treated 100 mm x 20 mm dish	Fisher Scientific	08-772-23
Trichloroacetic acid (TCA)	Thermo Scientific	AC421451000	Resuspend 100% w/v in HPLC grade water
Trifluoroacetic acid (TFA)	Fisher Scientific	PI28904	Sequencing grade
Vacuum manifold 96-well	Millipore	MAVM0960R
Vortex	Sigma-Aldrich	Z258415
Water bath	Fisher Scientific	FSGPD10
Wide bore pipet tips 1000 µL	Axygen	14-222-703 (Fisher Scientific)
Wide bore pipet tips 200 µL	Axygen	14-222-730 (Fisher Scientific)