Denne protokollen skisserer hvordan et tredimensjonalt cellekultursystem kan brukes til å modellere, behandle og analysere kromatinmodifikasjoner i en nesten fysiologisk tilstand.
Flate kulturer av pattedyrceller er en mye brukt in vitro tilnærming for å forstå cellefysiologi, men dette systemet er begrenset i modellering av faste vev på grunn av unaturlig rask cellereplikering. Dette er spesielt utfordrende når modellering av moden kromatin, da raske replikeringsceller ofte er involvert i DNA-replikasjon og har en heterogen polyploid populasjon. Presentert nedenfor er en arbeidsflyt for modellering, behandling og analyse av quiescent kromatin modifikasjoner ved hjelp av en tredimensjonal (3D) cellekultur system. Ved hjelp av denne protokollen vokser hepatocellulære karsinomcellelinjer som reproduserbare 3D-sfæroider i en inkubator som gir aktiv næringsdiffusjon og lave skjærekrefter. Behandling med natrium butyrat og natrium succinate induserte en økning i henholdsvis histonacetylering og kortfattethet. Økning i nivåer av histon acetylering og kortfattethet er forbundet med en mer åpen kromatintilstand. Sfæroider samles deretter inn for isolering av cellekjerner, hvorfra histoneproteiner ekstraheres for analyse av deres postoversettelsesendringer. Histone analyse utføres via flytende kromatografi koblet online med tandem masse spektrometri, etterfulgt av en intern beregningsrørledning. Til slutt vises eksempler på datarepresentasjon for å undersøke frekvensen og forekomsten av kombinatoriske histonemerker.
Siden slutten av 1800-tallet har cellekultursystemer blitt brukt som modell for å studere vekst og utvikling av celler utenfor menneskekroppen 1,2. Deres bruk har også blitt utvidet for å studere hvordan vev og organer fungerer i både sunne og syke sammenhenger 1,3. Suspensjonsceller (f.eks. blodceller) vokser i Petri-retter eller kolber sømløst og om hverandre, da de ikke samles i tredimensjonale (3D) strukturer in vivo. Celler avledet fra faste organer kan vokse i enten todimensjonale (2D) eller 3D-kultursystemer. I 2D-kultur dyrkes celler i en monolayer som holder seg til en flat overflate 2,4. 2D-cellekultursystemer er preget av eksponentiell vekst og en rask doblingstid, vanligvis 24 timer til noen dager5. Celler i 3D-systemer vokser for å danne intrikate cellecelleinteraksjoner som modellerer vevlignende konglomerater nærmere, og de er preget av deres evne til å nå en dynamisk likevekt der deres doblingstid kan nå 1 måned eller lenger5.
Presentert i dette dokumentet er en innovativ metodikk for å vokse 3D-sfæroider i roterende cellekultursystemer som simulerer redusert tyngdekraft6. Dette er et forenklet derivat av et cellekultursystem introdusert av NASA på 1990-tallet7. Denne tilnærmingen minimerer skjærekrefter, som forekommer i eksisterende metoder som spinnende kolber, og øker sfæroid reproduserbarhet6. I tillegg øker den roterende bioreaktoren aktiv næringsdiffusjon, og minimerer nekrotisk formasjon som forekommer i systemer som hengende dråpecellekultur der medieutveksling er upraktisk6. På denne måten vokser cellene for det meste uforstyrret, noe som muliggjør dannelse av strukturelle og fysiologiske egenskaper forbundet med celler som vokser i vev. C3A hepatocytter (HepG2/C3A) dyrket på denne måten hadde ikke bare ultrastrukturelle organeller, men produserte også mengder ATP, adenylatkinase, urea og kolesterol som kan sammenlignes med nivåer observert i vivo 1,2. I tillegg viser celler som vokser i 2D vs.3D cellekultursystemer forskjellige genuttrykksmønstre8. Genuttrykksanalyse av C3A-hepatocytter dyrket som 3D-sfæroider viste at disse cellene uttrykte et bredt spekter av leverspesifikke proteiner, samt gener involvert i viktige veier som regulerer leverfunksjonen8. Tidligere publikasjoner viste forskjellene mellom proteomer av eksponentielt voksende celler i 2D-kultur vs. celler ved dynamisk likevekt i 3D-sfæroidkulturer5. Disse forskjellene inkluderer cellulær metabolisme, som igjen påvirker strukturen, funksjonen og fysiologien til cellen5. Proteomet av celler dyrket i 2D-kultur var mer beriket i proteiner involvert i cellereplikering, mens proteomet av 3D-sfæroider var mer beriket i leverfunksjonalitet5.
Den langsommere replikeringshastigheten til celler som vokser som 3D-sfæroider, modellerer mer nøyaktig spesifikke fenomener forbundet med kromatintilstand og modifikasjoner (f.eks. histoneklipping9). Histone klipping er en irreversibel histone post-translasjonell modifikasjon (PTM) som forårsaker proteolytisk spalting av en del av histone N-terminal halen. Mens den biologiske funksjonen fortsatt er under diskusjon 10,11,12,13, er det klart at dens tilstedeværelse i primære celler og levervev er modellert av HepG2 / C3A celler vokst som sfæroider, men ikke som flate celler 9. Dette er kritisk, da kromatintilstand og modifikasjoner regulerer DNA-avlesning hovedsakelig ved å modulere tilgjengelighet til gener og dermed deres uttrykk14. Histone PTMer påvirker enten kromatintilstanden direkte ved å påvirke nettoladningen til nukleosomene der histoner er samlet, eller indirekte ved å rekruttere kromatinforfattere, lesere og viskelær14. Hundrevis av histone PTMer har blitt identifisert til dags dato15, forsterke hypotesen om at kromatin er vert for en “histone kode” som brukes av cellen til å tolke DNA16. Imidlertid er identifiseringen av et utall PTM-kombinasjoner15, og oppdagelsen av at kombinasjoner av histone PTMer ofte har forskjellige biologiske funksjoner fra PTMer tilstede isolert (f.eks. Fischle, et al.17), fremhever at det kreves mer arbeid for å dekryptere “histonekoden”.
For tiden er histone PTM-analyse enten basert på teknikker som bruker antistoffer (f.eks. vestlige flekker, immunfluorescens eller kromatinimoprecipitation etterfulgt av sekvensering [ChIP-seq]) eller massespektrometri (MS). Antistoffbaserte teknikker har høy følsomhet og kan gi detaljert informasjon om genom-bred lokalisering av histone merker, men er ofte begrenset i å studere sjeldne PTMer eller PTMer til stede i kombinasjoner 18,19,20. MS er mer egnet for høy gjennomstrømning og objektiv identifisering og kvantifisering av enkelt- og sameksisterte proteinmodifikasjoner, spesielt histoneproteiner 18,19,20. Av disse grunnene har dette og flere andre laboratorier optimalisert MS-rørledningen for analyse av histonepeptider (bottom-up MS), intakte histonehaler (middels ned MS) og histoneproteiner i full lengde (ovenfra og ned MS)21,22,23.
Nedenfor er en arbeidsflyt for dyrking av HepG2/C3A-sfæroider og klargjøring av dem for histonepeptidanalyse (bottom-up MS) via nano-flytende kromatografi, kombinert online med tandemmassespektrometri (nLC-MS/MS). En 2D-cellekultur ble dyrket og cellene ble høstet og overført til en bioreaktor hvor de skulle begynne å danne sfæroider (figur 1). Etter 18 dager i kultur ble sfæroider behandlet med natrium butyrat eller natrium succinate for å øke de relative overflodene av histonacetylering og kortfattethet. Spesielt kan 3D-kulturer behandles med gentoksiske forbindelser like godt som deres flate kulturekvivalenter; Faktisk fremhever nyere publikasjoner at toksikologiresponsen til celler i 3D-kultur er mer lik primærvev enn de i 2D flat kultur24,25. Celler ble deretter samlet inn på bestemte tidspunkter og kjernefysisk isolasjon ble utført. Deretter ble histoner ekstrahert og avlet med propionisk anhydrid før og etter trypsin fordøyelse i henhold til en protokoll først utviklet av Garcia et al.26. Denne prosedyren genererer peptider av riktig størrelse for online separasjon med omvendt fasekromatografi (C18) og deteksjon med MS. Til slutt ble histonepeptider identifisert og kvantifisert, og de genererte dataene var representert på flere måter for en mer fullstendig biologisk tolkning.
Analysen av histone PTMer er fundamentalt forskjellig fra den typiske proteomiske analyserørledningen. De fleste histone PTMs har fortsatt gåtefulle biologiske funksjoner; Som et resultat er merknader som Gene Ontology eller pathway-databaser ikke tilgjengelige. Det finnes flere ressurser som forbinder histone modifikasjoner med enzymet som er ansvarlig for deres katalyse eller proteiner som inneholder domener som binder disse PTM-ene (f.eks. HISTome36). I tillegg er det mulig å spekulere på d…
The authors have nothing to disclose.
Sidoli-laboratoriet anerkjenner takknemlig Leukemia Research Foundation (Hollis Brownstein New Investigator Research Grant), AFAR (Sagol Network GerOmics award), Deerfield (Xseed Award), Relay Therapeutics, Merck og NIH Office of the Director (1S10OD030286-01).
0.05% trypsin-EDTA solution | Gibco | 25300054 | |
0.5-20 µL pipet tips | BRAND | 13-889-172 (Fisher Scientific) | |
1.5 mL microcentrifuge tubes | Bio-Rad | 2239480 | |
10 µL multi-channel pipette | BRAND | BR7059000 (Millipore Sigma) | |
10 mL syringe | Henke Sass Wolf | 14-817-31 (Fisher Scientific) | Luer lock tip, graduated to 12 mL |
10, 20, 200, and 1000 µL single-channel pipettes | Eppendorf | 14-285-904 (Fisher Scientific) | |
1000 µL pipet tips | Rainin | 30389164 | |
18 G syringe needle | Air-Tite | 14-817-100 (Fisher Scientific) | 3" length, 0.05" diameter |
200 µL multi-channel pipette | Corning | 4082 | |
2-200 µL pipet tips | BRAND | Z740118 (Millipore Sigma) | |
24-well ultra-low attachment microplate | Corning | 07-200-602 | |
75 cm2 U-shaped cell culture flask | Corning | 461464U | Untreated, with vent cap |
96-well skirted plate | Axygen | PCR-96-FS-C (Corning) | |
Acetone | Fisher Scientific | A949-1 | Acetone should be used cold |
Ammonium bicarbonate (NH4HCO3) | Sigma-Aldrich | A6141-25G | |
Ammonium hydroxide solution | Fisher Scientific | AC423300250 | |
Cell culture grade water | Corning | 25-055-CV | |
ClinoReactor | CelVivo | 10004-12 | Bioreactor for 3D cell culture |
ClinoStar | CelVivo | N/A | Clinostat CO2 incubator for 3D cell culture |
Control unit | CelVivo | N/A | Tablet for ClinoStar settings |
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Corning | 17-205-CV | 1X solution with 4.5 g/L glucose and sodium pyruvate, without L-glutamine and phenol red |
Fetal bovine serum (FBS) | Corning | 35-010-CV | |
Formic acid | Thermo Scientific | 28905 | |
Fume hood | Mott | N/A | Model 7121000 |
Glass Pasteur pipette | Fisher Scientific | 13-678-8B | 9", cotton-plugged, borosilicate glass, non-sterile |
Glutagro supplement | Corning | 25-015-CI | 200 mM L-ananyl-L-glutamine |
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) | Corning | 21-022-CV | 1X solution without calcium, magnesium, and phenol red |
HPLC grade acetonitrile | Fisher Scientific | A955-4 | |
HPLC grade water | Fisher Scientific | W6-1 | |
Hydrochloric acid (HCl) | Fisher Scientific | A481-212 | |
Ice | N/A | N/A | |
MEM non-essential amino acids | Corning | 25-025-CI | 100X solution |
Oasis HLB resin | Waters | 186007549 | Hydrophilic-Lipophilic-Balanced (HLB) Resin with 30µm particle size |
Orbitrap Fusion Lumos Tribrid mass spectrometer | Thermo Fisher Scientific | IQLAAEGAAPFADBMBHQ | High resolution mass spectrometer |
Oro-Flex I polypropylene filter plate | Orochem | OF1100 | 96-well polypropylene filter plate w/ 10 µM PE frit |
Penicillin-Streptomycin | Corning | 30-002-CI | 100X solution |
pH paper | Hydrion | Z111848 (Sigma-Aldrich) | 0-13 pH test paper |
Pipette gun | Eppendorf | Z666467 (Millipore Sigma) | |
Polymicro capillary | Molex | 50-110-7740 (Fisher Scientific) | Flexible fused silica capillary tubing with polymide coating, 75 µM ID x 363 µM OD |
Polystyrene 10 mL serological pipets, sterile | Fisher Scientific | 1367549 | |
Propionic anhydride | Sigma-Aldrich | 240311-50G | |
Refrigerated centrifuge | Thermo Scientific | 75-217-420 | |
Reprosil-Pur resin | MSWIL | R13.AQ.0003 | 120 Å pore size, C18-AQ phase, 3 µM bead size |
Rotator | Clay Adams | 25477 (American Laboratory Trading) | Nutator Mixer 1105 |
Sequencing grade modified trypsin | Promega | V5111 | |
Sodium butyrate | Thermo Scientific | A11079 | |
Sodium succinate dibasic | Sigma-Aldrich | 14160-100G | |
SpeedVac vacuum concentrator (1.5 mL microcentrifuge tubes) | Savant | 20249 (American Laboratory Trading) | |
SpeedVac vacuum concentrator (96-well) | Thermo Scientific | 15308325 | Savant SPD1010 |
Sterile hood | Thermo Scientific | 1375 | Class II, Type A2 |
Sulfuric acid (H2SO4) | Fisher Scientific | 02-004-375 | Baker Analyzed ACS reagent |
Tissue-culture treated 100 mm x 20 mm dish | Fisher Scientific | 08-772-23 | |
Trichloroacetic acid (TCA) | Thermo Scientific | AC421451000 | Resuspend 100% w/v in HPLC grade water |
Trifluoroacetic acid (TFA) | Fisher Scientific | PI28904 | Sequencing grade |
Vacuum manifold 96-well | Millipore | MAVM0960R | |
Vortex | Sigma-Aldrich | Z258415 | |
Water bath | Fisher Scientific | FSGPD10 | |
Wide bore pipet tips 1000 µL | Axygen | 14-222-703 (Fisher Scientific) | |
Wide bore pipet tips 200 µL | Axygen | 14-222-730 (Fisher Scientific) |