Quantificação de nível global de modificações pós-translacionais histone em um modelo de cultura celular 3D de tecido hepático

Summary

Este protocolo descreve como um sistema de cultura celular tridimensional pode ser usado para modelar, tratar e analisar modificações de cromatina em um estado quase fisiológico.

Abstract

Culturas planas de células mamíferas são uma abordagem in vitro amplamente utilizada para a compreensão da fisiologia celular, mas este sistema é limitado na modelagem de tecidos sólidos devido à replicação celular não naturalmente rápida. Isso é particularmente desafiador quando modela cromatina madura, já que células de replicação rápida estão frequentemente envolvidas na replicação do DNA e têm uma população poliploide heterogênea. Apresentado abaixo é um fluxo de trabalho para modelar, tratar e analisar modificações quiescentes de cromatina usando um sistema de cultura celular tridimensional (3D). Usando este protocolo, as linhas celulares de carcinoma hepatocelular são cultivadas como esferoides 3D reprodutíveis em uma incubadora que fornece difusão ativa de nutrientes e baixas forças de salto. O tratamento com butirato de sódio e succinato de sódio induziu um aumento na acetilação de histona e succinilation, respectivamente. Aumentos nos níveis de acetilação de histona e succiniltação estão associados a um estado de cromatina mais aberto. Os spheróides são então coletados para isolamento de núcleos celulares, dos quais as proteínas histonas são extraídas para a análise de suas modificações pós-translacionais. A análise de histona é realizada através de cromatografia líquida acoplado on-line com espectrometria de massa tandem, seguido por um pipeline computacional interno. Finalmente, exemplos de representação de dados para investigar a frequência e ocorrência de marcas de histona combinatória são mostrados.

Introduction

Desde o final do século^XIX, os sistemas de cultura celular têm sido usados como modelo para estudar o crescimento e o desenvolvimento de células fora do corpo humano ^1,2. Seu uso também foi ampliado para estudar como os tecidos e órgãos funcionam em contextos saudáveis e doentes ^1,3. As células de suspensão (por exemplo, as células sanguíneas) crescem em placas de Petri ou frascos de forma perfeita e intercambiável, pois não se reúnem em estruturas tridimensionais (3D) in vivo. Células derivadas de órgãos sólidos podem crescer em sistemas de cultura bidimensional (2D) ou 3D. Na cultura 2D, as células são cultivadas em uma monocamada que adere a uma superfície plana ^2,4. Os sistemas de cultura celular 2D são caracterizados pelo crescimento exponencial e um tempo de duplicação rápida, tipicamente de 24h a poucos dias⁵. Células em sistemas 3D crescem para formar interações intrincadas células-células modelando conglomerados semelhantes a tecidos mais de perto, e são caracterizadas por sua capacidade de alcançar um equilíbrio dinâmico onde seu tempo de duplicação pode chegar a 1 mês ou mais⁵.

Apresentado neste artigo é uma metodologia inovadora para cultivar esferoides 3D em sistemas de cultura celular rotativa que simulam a gravidade reduzida⁶. Este é um derivado simplificado de um sistema de cultura celular introduzido pela NASA na década de 1990⁷. Essa abordagem minimiza as forças de shearing, que ocorrem em métodos existentes, como frascos giratórios, e aumenta a reprodutibilidade esferoide⁶. Além disso, o bioreator rotativo aumenta a difusão ativa de nutrientes, minimizando a formação necrótica que ocorre em sistemas como a cultura de células de queda pendurada onde a troca de mídia é impraticável⁶. Dessa forma, as células crescem em sua maioria sem serem perturbadas, permitindo a formação de características estruturais e fisiológicas associadas às células que crescem no tecido. Os hepatócitos C3A (HepG2/C3A) cultivaram dessa forma não só as organelas ultraestruturais, mas também produziram quantidades de ATP, quinase adenila, ureia e colesterol comparáveis aos níveis observados in vivo ^1,2. Além disso, as células cultivadas em sistemas de cultura celular 2D vs.3D exibem diferentes padrões de expressão genética⁸. A análise da expressão genética dos hepatócitos C3A cultivadas como esferoides 3D mostrou que essas células expressavam uma ampla gama de proteínas específicas do fígado, bem como genes envolvidos em caminhos-chave que regulam a função hepática⁸. Publicações anteriores demonstraram as diferenças entre os proteomes de células em crescimento exponencial na cultura 2D versus células em equilíbrio dinâmico nas culturas esferoides 3D⁵. Essas diferenças incluem o metabolismo celular, que por sua vez afeta a estrutura, função e fisiologia da célula⁵. O proteome das células cultivadas na cultura 2D foi mais enriquecido em proteínas envolvidas na replicação celular, enquanto o proteome de esferoides 3D foi mais enriquecido na funcionalidade hepática⁵.

A taxa de replicação mais lenta das células cultivadas como esferoides 3D modela com mais precisão fenômenos específicos associados ao estado de cromatina e modificações (por exemplo, recorte de histona⁹). O recorte de histona é uma modificação pós-translacional irreversível (PTM) que causa decote proteolítico de parte da cauda do terminal de histone. Enquanto sua função biológica ainda está em discussão 10,11,12,13, é claro que sua presença em células primárias e tecido hepático é modelada por células HepG2/C3A cultivadas como esferoides, mas não como células planas 9. Isso é crítico, pois o estado da cromatina e as modificações regulam a leitura de DNA principalmente através da modulação da acessibilidade aos genes e, portanto, sua expressão¹⁴. Os PTMs histonos ou influenciam diretamente o estado cromatina afetando a carga líquida dos nucleosmosos onde os histones são montados, ou indiretamente recrutando escritores, leitores e borrachas¹⁴. Centenas de PTMs histone foram identificados até o momento¹⁵, reforçando a hipótese de que a cromatina hospeda um “código histona” usado pela célula para interpretar o DNA¹⁶. No entanto, a identificação de uma miríade de combinações de PTM¹⁵, e a descoberta de que combinações de PTMs histone frequentemente têm funções biológicas diferentes de PTMs presentes isoladamente (por exemplo, Fischle, et ^al.17), destaca que mais trabalho é necessário para descriptografar o “código histona”.

Atualmente, a análise histone PTM é baseada em técnicas que utilizam anticorpos (por exemplo, manchas ocidentais, imunofluorescência ou imunoprecipitação de cromatina seguida de sequenciamento [ChIP-seq]) ou espectrometria de massa (MS). As técnicas baseadas em anticorpos têm alta sensibilidade e podem fornecer informações detalhadas sobre a localização em todo o genoma de marcas de histona, mas são frequentemente limitadas no estudo de PTMs raros ou PTMs presentes em combinações 18,19,20. A ESM é mais adequada para identificação e quantificação de proteínas únicas e coexistindo, em particular proteínas histonas 18,19,20. Por essas razões, este e vários outros laboratórios otimizaram o pipeline de MS para a análise de peptídeos de histona (ms de baixo para cima), caudas de histona intactas (MS médio-para baixo) e proteínas histonas de comprimento completo (MS de cima para baixo) 21,22,23.

Detalhado abaixo está um fluxo de trabalho para o crescimento de spheroids HepG2/C3A e prepará-los para análise de peptídeos histone (bottom-up MS) via cromatografia nano-líquida, juntamente com espectrometria de massa tandem (nLC-MS/MS). Uma cultura celular 2D foi cultivada e as células foram colhidas e transferidas para um bioreator onde começariam a formar esferoides (Figura 1). Após 18 dias na cultura, os esferoides foram tratados com butirato de sódio ou succinato de sódio para aumentar as abundâncias relativas de acetilação de histona e succinilation. Notavelmente, culturas 3D podem ser tratadas com compostos genotóxicos, bem como seus equivalentes de cultura plana; de fato, publicações recentes destacam que a resposta toxicológica das células na cultura 3D é mais semelhante aos tecidos primários do que aqueles na cultura plana 2D ^24,25. As células foram então coletadas em pontos de tempo especificados e o isolamento nuclear foi realizado. Em seguida, as histonas foram extraídas e derivadas com anidrido propionônico antes e depois da digestão da trippsina de acordo com um protocolo desenvolvido pela primeira vez por Garcia et ^al.26. Este procedimento gera peptídeos de tamanho adequado para separação on-line com cromatografia de fase inversa (C₁₈) e detecção com ESM. Finalmente, os peptídeos histonas foram identificados e quantificados, e os dados gerados foram representados de múltiplas formas para uma interpretação biológica mais completa.

Protocol

1. Preparação de tampões e reagentes Mídia de crescimento celular (para células HepG2/C3A): Adicionar soro bovino fetal (FBS) (10% v/v), aminoácidos não essenciais (1% v/v), suplemento l-glutamina (1% v/v) e penicilina/estreptomicina (0,5% v/v) ao Médio De Águia Modificada de Dulbecco (DMEM, contendo glicose de 4,5 g/L). A mídia de crescimento é armazenada a 4 °C por uma máxima de 2 semanas. Solução de butirato de sódio de 200 mM (NaBut): Para preparar 10 mL, resuspend…

Representative Results

Neste protocolo, os esferoides HepG2/C3A foram tratados com 20 mM NaBut e 10 mM NaSuc, ambos áfetou os níveis globais de PTMs histone (Figura 3A). Os PTMs de histone foram então identificados e quantificados no nível único de resíduos via aquisição de MS/MS (Figura 3B). Quando as amostras são executadas em réplicas, a análise estatística pode ser realizada para avaliar o enriquecimento da mudança de dobra de um P…

Discussion

A análise dos PTMs histone é fundamentalmente diferente do típico pipeline de análise de proteômica. A maioria dos PTMs histone ainda tem funções biológicas enigmáticas; como resultado, anotações como Gene Ontology ou bancos de dados de caminhos não estão disponíveis. Existem vários recursos que associam modificações de histona à enzima responsável por sua catálise ou proteínas que contenham domínios que ligam esses PTMs (por exemplo, HISTome³⁶). Além disso, é possível esp…

Materials

0.05% trypsin-EDTA solution	Gibco	25300054
0.5-20 µL pipet tips	BRAND	13-889-172 (Fisher Scientific)
1.5 mL microcentrifuge tubes	Bio-Rad	2239480
10 µL multi-channel pipette	BRAND	BR7059000 (Millipore Sigma)
10 mL syringe	Henke Sass Wolf	14-817-31 (Fisher Scientific)	Luer lock tip, graduated to 12 mL
10, 20, 200, and 1000 µL single-channel pipettes	Eppendorf	14-285-904 (Fisher Scientific)
1000 µL pipet tips	Rainin	30389164
18 G syringe needle	Air-Tite	14-817-100 (Fisher Scientific)	3" length, 0.05" diameter
200 µL multi-channel pipette	Corning	4082
2-200 µL pipet tips	BRAND	Z740118 (Millipore Sigma)
24-well ultra-low attachment microplate	Corning	07-200-602
75 cm2  U-shaped cell culture flask	Corning	461464U	Untreated, with vent cap
96-well skirted plate	Axygen	PCR-96-FS-C (Corning)
Acetone	Fisher Scientific	A949-1	Acetone should be used cold
Ammonium bicarbonate (NH4HCO3)	Sigma-Aldrich	A6141-25G
Ammonium hydroxide solution	Fisher Scientific	AC423300250
Cell culture grade water	Corning	25-055-CV
ClinoReactor	CelVivo	10004-12	Bioreactor for 3D cell culture
ClinoStar	CelVivo	N/A	Clinostat CO2 incubator for 3D cell culture
Control unit	CelVivo	N/A	Tablet for ClinoStar settings
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)	Corning	17-205-CV	1X solution with 4.5 g/L glucose and sodium pyruvate, without L-glutamine and phenol red
Fetal bovine serum (FBS)	Corning	35-010-CV
Formic acid	Thermo Scientific	28905
Fume hood	Mott	N/A	Model 7121000
Glass Pasteur pipette	Fisher Scientific	13-678-8B	9", cotton-plugged, borosilicate glass, non-sterile
Glutagro supplement	Corning	25-015-CI	200 mM L-ananyl-L-glutamine
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS)	Corning	21-022-CV	1X solution without calcium, magnesium, and phenol red
HPLC grade acetonitrile	Fisher Scientific	A955-4
HPLC grade water	Fisher Scientific	W6-1
Hydrochloric acid (HCl)	Fisher Scientific	A481-212
Ice	N/A	N/A
MEM non-essential amino acids	Corning	25-025-CI	100X solution
Oasis HLB resin	Waters	186007549	Hydrophilic-Lipophilic-Balanced (HLB) Resin with 30µm particle size
Orbitrap Fusion Lumos Tribrid mass spectrometer	Thermo Fisher Scientific	IQLAAEGAAPFADBMBHQ	High resolution mass spectrometer
Oro-Flex I polypropylene filter plate	Orochem	OF1100	96-well polypropylene filter plate w/ 10 µM PE frit
Penicillin-Streptomycin	Corning	30-002-CI	100X solution
pH paper	Hydrion	Z111848 (Sigma-Aldrich)	0-13 pH test paper
Pipette gun	Eppendorf	Z666467 (Millipore Sigma)
Polymicro capillary	Molex	50-110-7740 (Fisher Scientific)	Flexible fused silica capillary tubing with polymide coating, 75 µM ID x 363 µM OD
Polystyrene 10 mL serological pipets, sterile	Fisher Scientific	1367549
Propionic anhydride	Sigma-Aldrich	240311-50G
Refrigerated centrifuge	Thermo Scientific	75-217-420
Reprosil-Pur resin	MSWIL	R13.AQ.0003	120 Å pore size, C18-AQ phase, 3 µM bead size
Rotator	Clay Adams	25477 (American Laboratory Trading)	Nutator Mixer 1105
Sequencing grade modified trypsin	Promega	V5111
Sodium butyrate	Thermo Scientific	A11079
Sodium succinate dibasic	Sigma-Aldrich	14160-100G
SpeedVac vacuum concentrator (1.5 mL microcentrifuge tubes)	Savant	20249 (American Laboratory Trading)
SpeedVac vacuum concentrator (96-well)	Thermo Scientific	15308325	Savant SPD1010
Sterile hood	Thermo Scientific	1375	Class II, Type A2
Sulfuric acid (H2SO4)	Fisher Scientific	02-004-375	Baker Analyzed ACS reagent
Tissue-culture treated 100 mm x 20 mm dish	Fisher Scientific	08-772-23
Trichloroacetic acid (TCA)	Thermo Scientific	AC421451000	Resuspend 100% w/v in HPLC grade water
Trifluoroacetic acid (TFA)	Fisher Scientific	PI28904	Sequencing grade
Vacuum manifold 96-well	Millipore	MAVM0960R
Vortex	Sigma-Aldrich	Z258415
Water bath	Fisher Scientific	FSGPD10
Wide bore pipet tips 1000 µL	Axygen	14-222-703 (Fisher Scientific)
Wide bore pipet tips 200 µL	Axygen	14-222-730 (Fisher Scientific)