Digitale ruimtelijke profilering voor karakterisering van de micro-omgeving in diffuus infiltrerend glioom van het volwassen type

Summary

Proteomische ontregeling speelt een belangrijke rol bij de verspreiding van diffuus infiltrerende gliomen, maar verschillende relevante eiwitten blijven ongeïdentificeerd. Digitale ruimtelijke verwerking (DSP) biedt een efficiënte, high-throughput benadering voor het karakteriseren van de differentiële expressie van kandidaat-eiwitten die kunnen bijdragen aan de invasie en migratie van infiltratieve gliomen.

Abstract

Diffuus infiltrerende gliomen zijn geassocieerd met hoge morbiditeit en mortaliteit als gevolg van de infiltratieve aard van tumorverspreiding. Het zijn morfologisch complexe tumoren, met een hoge mate van proteomische variabiliteit over zowel de tumor zelf als zijn heterogene micro-omgeving. Het kwaadaardige potentieel van deze tumoren wordt versterkt door de ontregeling van eiwitten die betrokken zijn bij verschillende belangrijke routes, waaronder processen die de cellulaire stabiliteit handhaven en de structurele integriteit van de micro-omgeving behouden. Hoewel er talloze bulk- en eencellige glioomanalyses zijn geweest, is er een relatief gebrek aan ruimtelijke stratificatie van deze proteomische gegevens. Het begrijpen van verschillen in ruimtelijke verdeling van tumorigene factoren en immuuncelpopulaties tussen de intrinsieke tumor, invasieve rand en micro-omgeving biedt waardevol inzicht in de mechanismen die ten grondslag liggen aan tumorproliferatie en -verspreiding. Digitale ruimtelijke profilering (DSP) vertegenwoordigt een krachtige technologie die de basis kan vormen voor deze belangrijke meerlagige analyses.

DSP is een methode die efficiënt eiwitexpressie kwantificeert binnen door de gebruiker gespecificeerde ruimtelijke gebieden in een weefselmonster. DSP is ideaal voor het bestuderen van de differentiële expressie van meerdere eiwitten binnen en tussen onderscheidregio’s, waardoor meerdere niveaus van kwantitatieve en kwalitatieve analyse mogelijk zijn. Het DSP-protocol is systematisch en gebruiksvriendelijk, waardoor ruimtelijke analyse van proteomische gegevens op maat mogelijk is. In dit experiment worden weefselmicroarrays opgebouwd uit gearchiveerde glioblastoomkernbiopten. Vervolgens wordt een panel van antilichamen geselecteerd, gericht op eiwitten van belang in het monster. De antilichamen, die worden voorgeconjugeerd tot UV-fotocleavable DNA-oligonucleotiden, worden vervolgens ‘s nachts geïncubeerd met het weefselmonster. Onder fluorescentiemicroscopievisualisatie van de antilichamen worden regio’s van belang (ROI’s) gedefinieerd waarbinnen eiwitexpressie kan worden gekwantificeerd met de monsters. UV-licht wordt vervolgens gericht op elke ROI, waarbij de DNA-oligonucleotiden worden gesplitst. De oligonucleotiden worden gemicroaspirateerd en geteld binnen elke ROI, waarbij het overeenkomstige eiwit op ruimtelijke basis wordt gekwantificeerd.

Introduction

Diffuus infiltrerende gliomen zijn het meest voorkomende type kwaadaardige hersentumor bij volwassenen en zijn steevast dodelijk. De neiging voor glioomcellen om uitgebreid in de hersenen te migreren is een grote therapeutische uitdaging. Het mechanisme waarmee ze zich verspreiden, omvat gerichte migratie en ongecontroleerde invasie. Van invasieve glioomcellen is aangetoond dat ze tropisme en migratie vertonen langs witte stofkanalen¹, waarbij recent onderzoek demyelinisatie van deze kanalen impliceert als een actief, protumorigene eigenschap². Invasie wordt gemedieerd door een epitheliale naar mesenchymale overgang, waarbij glioomcellen mesenchymale eigenschappen verwerven door de expressie van genen die coderen voor extracellulaire matrixeiwitten en celadhesiemoleculen te verminderen, migratie te versterken en de voortplanting door de tumormicro-omgeving te vergemakkelijken ^3,4,5.

Op moleculair niveau is verstoring van verschillende eiwitten aangetoond die cellulaire stabiliteit en interface met immunogene componenten verlenen⁶. Van infiltratieve gliomen is bekend dat ze onderdrukking ondergaan van eiwitten met anti-apoptotische (bijv. PTEN) eigenschappen⁷. Ze overexpressie ook eiwitten die het ontwijken van de immuunrespons van de gastheer bevorderen (bijv. PD1 / PDL1)⁸. De ontregeling van deze complexe paden verbetert de tumorigeniciteit en verhoogt het kwaadaardige potentieel.

Binnen monsters van invasief glioom was het doel om de differentiële expressie van eiwitten te evalueren die essentieel zijn voor celgroei, overleving en proliferatie, en voor de structurele integriteit van micro-omgeving tussen invasieve en niet-invasieve componenten. Daarnaast probeerden we de differentiële regulatie van eiwitten met een actieve immunogene rol te bestuderen, waardoor we inzicht kregen in het mechanisme waarmee gecompromitteerde immuunafweer van de gastheer het proliferatieve en invasieve potentieel van gliomen kan verbeteren. Dit is vooral relevant gezien de recente breedte van onderzoek dat aantoont hoe immuunmarkers en drivers van ontregeling bij maligniteit kunnen dienen als doelwitten van immunotherapie. Het identificeren van levensvatbare therapeutische doelen onder de vele eiwitten die betrokken zijn bij immunosurveillance en reactiviteit vereist een zeer gevoelige en alomvattende aanpak.

Gezien het brede scala aan kandidaat-eiwitten dat kan worden bestudeerd, zochten we naar een methode die lijkt op immunohistochemie, maar met verbeterde efficiëntie van gegevensverwerking. Op het gebied van kankerbiologie is DSP naar voren gekomen als een krachtige technologie met belangrijke voordelen ten opzichte van alternatieve hulpmiddelen voor proteomische analyse en kwantificering. Het kenmerk van DSP is de multiplexing-capaciteit met hoge doorvoer, waardoor gelijktijdige studie van verschillende eiwitten in een monster mogelijk is, wat een belangrijk onderscheid markeert met standaard maar lagere plextechnologieën zoals immunohistochemie (IHC)^9,10. De multiplexfunctie van DSP doet geen afbreuk aan de betrouwbaarheid ervan als een kwantitatief en analytisch hulpmiddel, zoals aangetoond door studies die DSP vergelijken met IHC. Bij gebruik voor proteomische kwantificering van niet-kleincellige longkankermonsters, bijvoorbeeld, is aangetoond dat DSP vergelijkbare resultaten heeft als IHC¹¹. Bovendien biedt DSP aanpasbare regionale specificatie, waarin gebruikers handmatig regio’s kunnen definiëren waarbinnen proteomische analyse kan worden uitgevoerd. Dit biedt een voordeel ten opzichte van multiplexmethoden met een hele sectie^10,12. In een enkele verwerkingsronde biedt DSP dus meerdere analyselagen door verschillende eiwitdoelen in meerdere interessegebieden te onderzoeken.

DSP heeft toepassingen in verschillende pathologische omgevingen. DSP is vooral voordelig in oncologische analyse, omdat ruimtelijke variatie kan correleren met cellulaire transformatie en differentiële eiwitexpressie. DSP is bijvoorbeeld gebruikt om het proteomische profiel van borstkanker te vergelijken met de aangrenzende tumormicro-omgeving. Dit heeft belangrijke implicaties voor het begrijpen van de natuurlijke geschiedenis van deze tumor en de progressie ervan, evenals de mogelijke respons op behandeling¹³. Aanvullende contexten die de veelzijdigheid van DSP illustreren, zijn onder meer ruimtelijke kwantificering van eiwitdiversiteit bij prostaatkanker¹⁴, associatie van immuuncelmarkerexpressie met ziekteprogressie in hoofd-hals plaveiselcelcarcinoom¹⁵, en demonstratie van een epitheliaal-mesenchymale gradiënt van eiwitexpressie die gemetastaseerde van primaire heldercellige eierstokkanker onderscheidt¹⁶ . Door DSP te implementeren, karakteriseren we de ruimtelijke topografie van eiwitten die tumorigenese en invasie van gliomen kunnen beïnvloeden.

Protocol

Het onderstaande protocol volgt de richtlijnen van de Dartmouth-Hitchcock Human Research Ethics Committee. Geïnformeerde toestemming werd verkregen van de patiënten van wie weefselmonsters in dit onderzoek waren opgenomen. Zie de sectie Tabel met materialen voor meer informatie over alle materialen, reagentia, apparatuur en software die in dit protocol worden gebruikt. 1. Dia voorbereiding17 Ophalen of bereiden formaline-gef…

Representative Results

Figuur 4 toont de representatieve resultaten van een DSP-experiment uitgevoerd op monsters van glioblastoom. Er wordt een heatmap gepresenteerd, die een van de methoden illustreert waarmee gegevens visueel kunnen worden vastgelegd met behulp van de DSP-software. Rijen vertegenwoordigen eiwitdoelen en elke kolom komt overeen met een interessegebied. Een kleurbereik van blauw tot rood duidt respectievelijk op een lage tot hoge expressie. Variabiliteit van kleur binnen een rij weerspiegelt regi…

Discussion

Gezien de diversiteit aan eiwitten die mogelijk de agressiviteit van gliomen kunnen beïnvloeden en het idee dat verschillende van deze eiwitten onontdekt blijven, is een high-throughput eiwitkwantificeringsmethode een ideale technologische benadering. Aangezien ruimtelijke gegevens in oncologische monsters vaak correleren met differentiële expressie¹⁸, maakt het opnemen van ruimtelijke profilering in de eiwitkwantificeringsbenadering bovendien een effectievere analyse mogelijk.

<p class="jov…

Materials

BOND Research Detection System	Leica Biosystems, Wetzlar, Germany	DS9455	Open detection system containing open containers in a reagent tray
BOND Wash	Leica Biosystems, Wetzlar, Germany	AR950	10X concentrated buffer solution for washing fixed tissue
Buffer W	NanoString, Seattle, WA	contact company	Blocking reagent
Cy3 conjugation kit	Abcam, Cambridge, UK	AB188287	Cy3 fluorescent antibody conjugation kit
GeoMx Digital Spatial Profiler (DSP)	NanoString, Seattle, WA	contact company	System for imaging and characterizing protein and RNA targets
GeoMx DSP Instrument BufferKit	NanoString, Seattle, WA	100471	Buffer kit for GeoMX DSP (including buffers for sample processing and preparation)
GeoMx Hyb Code Pack_Protein	NanoString, Seattle, WA	121300401	Controls for running GeoMX DSP experiemtns
GeoMx Immune Cell Panel (Imm Cell Pro_Hs)	NanoString, Seattle, WA	121300101	Protein module with targets for human immune cells and immuno-oncologic targets
GeoMx Pan-Tumor Panel (Pan-Tumor_Hs)	NanoString, Seattle, WA	121300105	Protein module with targets for multiple human tumor types and for markers of epithelial-mesenchymal transition
GeoMx Protein Slide Prep FFPE	NanoString, Seattle, WA	121300308	Sample preparation reagents for GeoMX DSP protein analysis
IDH1-R132H antibody	Dianova, Hamburg, Germany	DIA-H09	Monoclonal antibody against human IDH1 R132H
LEICA Bond RX	Leica Biosystems, Wetzlar, Germany	contact company	Fully automated IHC stainer
Master Kit–12 reactions	NanoString, Seattle, WA	100052	Materials and reagents for use with the nCounter Analysis system
nCounter Analysis System	NanoString, Seattle, WA	contact company	Automated system for multiplex target expression quantification (to be used with GeoMx DSP)
TMA Master II	3DHistech Ltd., Budapest, Hungary		To create the tissue microarray block