Mønstergenerering til mikromønstertrækkraftmikroskopi
Summary
Vi beskriver forbedringer af en standardmetode til måling af cellulære trækkrafter baseret på mikrokontaktudskrivning med et enkelt subtraktivt mønstertrin af dot arrays af ekstracellulære matrixproteiner på bløde hydrogeler. Denne metode giver mulighed for enklere og mere konsekvent fremstilling af ømønstre, der er afgørende for at kontrollere celleklyngeformen.
Abstract
Mikromønster trækkraftmikroskopi tillader kontrol af formen af enkeltceller og celleklynger. Desuden tillader evnen til at mønstre på mikrometerlængdeskalaen brugen af disse mønstrede kontaktzoner til måling af trækkraft, da hver mikromønstret prik muliggør dannelsen af en enkelt fokal vedhæftning, som derefter deformerer den bløde, underliggende hydrogel. Denne tilgang er blevet anvendt til en bred vifte af celletyper, herunder endotelceller, glatte muskelceller, fibroblaster, blodplader og epitelceller.
Denne gennemgang beskriver udviklingen af teknikker, der tillader udskrivning af ekstracellulære matrixproteiner på polyacrylamidhydrogeler i et regelmæssigt udvalg af prikker af forudspecificeret størrelse og afstand. Da mikrometerskalamønstre er vanskelige at udskrive direkte på bløde underlag, genereres mønstre først på stive glasdæksler, der derefter bruges til at overføre mønsteret til hydrogelen under gelering. For det første beskrives den originale mikrokontaktudskrivningsmetode til at generere arrays af små prikker på omslagssedlen. Et andet trin, der fjerner det meste af mønsteret for at forlade øer med små prikker, er nødvendigt for at kontrollere formerne af celler og celleklynger på sådanne arrays af mønstrede prikker.
Dernæst beskrives en udvikling af denne tilgang, der muliggør generering af øer af prikker ved hjælp af et enkelt subtraktivt mønstertrin. Denne tilgang er stærkt forenklet for brugeren, men har ulempen ved en nedsat levetid for masterformen, der er nødvendig for at fremstille mønstrene. Endelig beskrives de beregningsmetoder, der er udviklet til analyse af billeder af forskudte prikker og efterfølgende cellegenererede trækkraftfelter, og opdaterede versioner af disse analysepakker leveres.
Introduction
De fleste cellefænotyper udøver trækkraft på deres miljø. Disse trækkrafter genereres af en celles kontraktile cytoskelet, som er et netværk af actin og myosin og andre trådformede biopolymerer og tværbindingsproteiner 1,2,3,4. Kræfter, der genereres i cellen, kan overføres til det ekstracellulære miljø eller tilstødende celler, primært via transmembranproteiner såsom integriner og cadheriner, henholdsvis 5,6. Hvordan en celle spredes eller trækker sig sammen – og størrelsen af de trækkrafter, der er forbundet med disse bevægelser – er resultatet af en intim samtale med sit miljø, som i vid udstrækning afhænger af typen og mængden af protein, der er til stede i den ekstracellulære matrix (ECM)7,8 og stivheden af ECM. Faktisk er trækkraftmikroskopi blevet et uvurderligt værktøj til at forstå celleresponsivitet over for lokale stimuli såsom substratstivhed, pålagt mekaniske belastninger og stammer eller kontakt med andre celler. Disse oplysninger er direkte relevante for forståelsen af sygdomme som kræft og astma 9,10,11,12.
Et system, der kan bruges til at måle kraftinduceret deformation af et substrat med kendte materialeegenskaber, er nødvendigt for at beregne trækkraft. Disse ændringer skal spores over tid, hvilket kræver både billedbehandlings- og billedbehandlingsteknikker. En af de første metoder, der blev brugt til at bestemme cellulære trækkrafter, var observation og analyse af sammentrækningen af kollagenhydrogeler podet med celler, selvom denne metode kun var semikvantitativ13. En anden, mere raffineret metode var at måle de trækkrafter, der udøves af enkeltceller, ved at bestemme de kræfter, der er resultatet af deformationen af et tyndt ark silikone14. Senere blev der udviklet mere kvantitative måleteknikker, og disse metoder tillod også anvendelse af bløde hydrogeler såsom polyacrylamid (PAA)12,15,16. Ved anvendelse af disse bløde materialer kunne trækkraften bestemmes ud fra den kraftinducerede forskydning af tilfældigt forskudte perler indlejret i hydrogelen og de mekaniske egenskaber af gelen16,17. Et andet fremskridt kom med udviklingen af mikropostarrays lavet af blød polydimethylsiloxan (PDMS), så deres afbøjning kunne måles og konverteres til kraft ved hjælp af stråleteorien18.
Endelig blev der udviklet metoder til mikromønster af bløde hydrogeler, da disse tilgange tillader kontrol af kontaktområderne for celleadhæsion. Ved at måle deformationen af mikromønsteret inden for en celles kontaktområde kan trækkraften let beregnes, fordi der ikke kræves et kraftfrit referencebillede19. Denne metode er blevet bredt vedtaget, da den giver mulighed for indirekte mønster af et regelmæssigt udvalg af mikron-størrelse, diskrete fluorescerende proteinadhæsionspunkter på PAA-geler til måling af cellulære trækkraftkræfter20. For at beregne disse kræfter er der udviklet en billedbehandlingsalgoritme, der kan spore bevægelserne af hver mikromønstret prikke uden at kræve brugerinput21.
Mens denne metode er enkel til at skabe hele gitre af prikker mønstre, er det mere kompliceret, når mønstre af isolerede patches (eller øer) af prikker ønskes. Mikromønstrede øer er nyttige, når der er behov for kontrol af form og til en vis grad af størrelse af klynger af celler. For at skabe disse øer kræver den førnævnte metode til mikrokontaktudskrivning to forskellige trin: i) brug af et PDMS-stempel til at skabe et high-fidelity-mønster af prikker på et omslagsseddel og derefter ii) brug af et andet andet PDMS-stempel til at fjerne de fleste af disse prikker og efterlade isolerede øer af prikker21. Vanskeligheden ved at skabe øer med denne oprindelige metode forværres af det faktum, at det er udfordrende i sig selv at lave konsistente gittermønstre i det første trin i processen. Mikroprintstempler består af en række cirkulære mikrostolper, hvis diameter svarer til den ønskede prpoststørrelse. Disse frimærker belægges derefter med et jævnt lag protein og stemples derefter med en præcis mængde tryk på behandlede dæksedler for at skabe det ønskede mønster. På den ene side kan påføring af for meget tryk på frimærket resultere i ujævn proteinoverførsel og dårlig mønstertroskab på grund af søjlespændning eller sagging mellem søjler, hvilket fører til kontakt med glasset. På den anden side resulterer anvendelse af for lidt tryk i lidt eller ingen proteinoverførsel og dårlig mønstertroskab. Af disse grunde ønskes en overførselsproces, der kan bruges til konsekvent at skabe mikromønstre af høj kvalitet af isolerede øer af prikker i kun et trin.
Heri beskrives en metode til indirekte mikromønster af øer af fluorescerende proteinadhæsionspunkter i mikronstørrelse på en PAA-gel, der er mere konsistent og alsidig end tidligere udviklede metoder. Mens ældre indirekte mikromønstermetoder er afhængige af overførsel af proteinmønstre fra et PDMS-stempel til et mellemliggende substrat, bruger den metode, der introduceres her, PDMS-stempler i stedet som et kar til proteinfjernelse, ikke tilsætning. Dette gøres ved først fundamentalt at ændre strukturen af de anvendte PDMS-frimærker. I stedet for at lave frimærker, der er sammensat af et mønster af jævnt fordelte cirkulære søjler, består frimærker af et mønster af jævnt fordelte cirkulære huller i denne metode.
Med denne nye struktur kan overfladen på disse PDMS-frimærker derefter behandles med glutaraldehyd som beskrevet tidligere 20,29,30, hvilket gør frimærket i stand til at binde kovalent med protein. Når de anvendes på et glasdæksler, der er jævnt belagt med fluorescerende protein, bruges disse glutaraldehydbehandlede PDMS-stempler til at fjerne det meste af proteinet på overfladen af dæksedlen og efterlader kun det ønskede mønster af prikker, der er forudbestemt af placeringen af mikronstore huller på frimærket. Denne ændring øger succesraten for at generere mønstre, der består af et næsten kontinuerligt gitter af prikker og for at skabe isolerede øer af prikker gennem kun et trin.
Protocol
Representative Results
Discussion
En forbedret metode til indirekte mønster af PAA-hydrogeler er beskrevet i dette papir. Denne tilgang bygger på metoder, der tidligere har været anvendt 20,35,36,37,38,39,40,41,42. Den primære ændring er, at PDMS-stem…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne vil gerne takke Dr. Paul Barbone fra Boston University Department of Mechanical Engineering for nyttige diskussioner og hjælp til dataanalyse. Denne undersøgelse blev støttet af NSF-bevilling CMMI-1910401.
Materials
| (3-aminopropyl)trimethoxysilane | Sigma Aldrich | #281778 | |
| 1.5 mL Microcentrifuge tube | Fisher Scientific | #05-408-129 | |
| 15 mL conical tube | Fisher Scientific | #05-539-12 | |
| 4 x 4 in 0.060 Quartz LR Chrome Photomask | Advance Reproductions Corporation | N/A | Custom-designed mask |
| 6 Well Plates | Fisher Scientific | #07-200-83 | |
| Acetone | Fisher Scientific | #A18P-4 | |
| Acrylamide Solution, 40% | Sigma Aldrich | #A4058 | |
| AlexaFluor 488 | Thermo Fisher | #A20000 | |
| Aminonium Persulfate | Fisher Scientific | #BP179-25 | |
| Bisacrylamide | Fisher Scientific | #PR-V3141 | |
| Ethanol | Greenfield Global | #111000200C1GL | |
| Glass Coverslips, 25 mm round | Fisher Scientifc | #12-545-102 | |
| Glass Coverslips, 30 mm round | Warner | #64-1499 | |
| Hamamatsu ORCA-R2 Camera | Hamamatsu | #C10600-10B | |
| Human Plasma | Valley Biomedical | #HP1051P | Used to isolate fibronectin |
| Hydrochloric Acid, 1.0 N | Millipore Sigma | #1.09057 | |
| ImageJ | Wayne Rasband | #1.53n | |
| Interchangeable Coverslip Dish Set | Bioptechs | #190310-35 | |
| Kim Wipes | Fisher Scientific | #06-666-11C | |
| Mask Alinger | Karl Suss | #MA6 | |
| Matlab 2021 | Mathworks | #R2021a | |
| MetaMorph Basic | Molecular Devices | #v7.7.1.0 | |
| N-hydroxysuccinimide ester | Sigma Aldrich | #130672-5G | |
| NucBlue Live Cell Stain | Thermo Fisher | #R37605 | |
| Olympus IX2-ZDC Inverted Microscope | Olympus | #IX81 | |
| PD-10 Desalting Columns | GE Healthcare | #52-1308-00 | |
| Photoresist Spinner Hood | Headway Research | #PWM32 | |
| Plasma Cleaner | Harrick | #PDC-001 | |
| Plasma Etcher | TePla | #M4L | |
| Prior Lumen 200Pro Light Source | Prior Scientific | #L200 | |
| Silicon Wafers, 100 mm | University Wafer | #809 | |
| SU-8 2005 | Kayaku Advanced Materials Inc. | #NC9463827 | |
| SU-8 Developer | Kayaku Advanced Materials Inc. | #NC9901158 | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer | Essex Brownell | #DC-184-1.1 | |
| Tetramethylethylenediamine | Fisher Scientific | #BP150-20 | |
| Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane | Sigma Aldrich | #448931 | |
| UAPON-40XW340 Objective | Olympus | #N2709300 | |
| UV Flood Exposure | Newport | #69910 | |
| Wafer Carrier Tray, 110 x 11 mm | Ted Pella, Inc. | #19395-40 |
Riferimenti
- Pelham, R. J., Wang, Y. Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate flexibility. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (25), 13661-13665 (1997).
- Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. L. Tissue cells feel and respond to the stiffness of their substrate. Science. 310 (5751), 1139-1143 (2005).
- Tambe, D. T., et al. Monolayer stress microscopy: limitations, artifacts, and accuracy of recovered intercellular stresses. PLoS One. 8 (2), 55172 (2013).
- Bhadriraju, K., et al. Activation of ROCK by RhoA is regulated by cell adhesion, shape, and cytoskeletal tension. Experimental Cell Research. 313 (16), 3616-3623 (2007).
- Stricker, J., Falzone, T., Gardel, M. L. Mechanics of the F-actin cytoskeleton. Journal of Biomechanics. 43 (1), 9-14 (2010).
- Ganz, A., et al. Traction forces exerted through N-cadherin contacts. Biology of the Cell. 98 (12), 721-730 (2006).
- Chopra, A., et al. Reprogramming cardiomyocyte mechanosensing by crosstalk between integrins and hyaluronic acid receptors. Journal of Biomechanics. 45 (5), 824-831 (2012).
- Winer, J. P., Chopra, A., Kresh, J. Y., Janmey, P. A. Substrate elasticity as a probe to measure mechanosensing at cell-cell and cell-matrix junctions. Mechanobiology of cell-cell and cell-matrix interactions. , 11-22 (2011).
- Munevar, S., Wang, Y., Dembo, M. Traction force microscopy of migrating normal and H-ras transformed 3T3 fibroblasts. Biophysical Journal. 80 (4), 1744-1757 (2001).
- Kraning-Rush, C. M., Califano, J. P., Reinhart-King, C. A. Cellular traction stresses increase with increasing metastatic potential. PLoS One. 7 (2), 32572 (2012).
- Lavoie, T. L., et al. Disrupting actin-myosin-actin connectivity in airway smooth muscle as a treatment for asthma. Proceedings of the American Thoracic Society. 6 (3), 295-300 (2009).
- Kraning-Rush, C. M., et al. Quantifying traction stresses in adherent cells. Methods in Cell Biology. 110, 139-178 (2012).
- Halliday, N. L., Tomasek, J. J. Mechanical properties of the extracellular matrix influence fibronectin fibril assembly in vitro. Experimental Cell Research. 217 (1), 109-117 (1995).
- Harris, A. K., Wild, P., Stopak, D. Silicone rubber substrata: a new wrinkle in the study of cell locomotion. Science. 208 (4440), 177-179 (1980).
- Aratyn-Schaus, Y., et al. Preparation of complaint matrices for quantifying cellular contraction. Journal of Visualized Experiments:JoVE. (46), e2173 (2010).
- Dembo, M., Wang, Y. L. Stresses at the cell-to-substrate interface during locomotion of fibroblasts. Biophysical Journal. 76 (4), 2307-2316 (1999).
- Sniadecki, N. J., Chen, C. S. Microfabricated silicone elastomeric post arrays for measuring traction forces of adherent cells. Methods in Cell Biology. 83, 313-328 (2007).
- Tan, J. L., et al. Cells lying on a bed of microneedles: An approach to isolate mechanical force. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (4), 1484-1489 (2003).
- Tseng, Q., et al. A new micropatterning method of soft substrates reveals that different tumorigenic signals can promote or reduce cell contraction levels. Lab on a Chip. 11 (13), 2231-2240 (2011).
- Polio, S. R., Smith, M. L. Patterned hydrogels for simplified measurement of cell traction forces. Methods in Cell Biology. 121, 17-31 (2014).
- Polio, S. R., et al. Topographical control of multiple cell adhesion molecules for traction force microscopy. Integrative Biology. 6 (3), 357-365 (2014).
- Balaban, N. Q., et al. Force and focal adhesion assembly: a close relationship studied using elastic micropatterned substrates. Nature Cell Biology. 3 (5), 466-472 (2001).
- Maloney, J. M., et al. Influence of finite thickness and stiffness on cellular adhesion-induced deformation of compliant substrata. Physical Review. E, Statistical, Nonlinear, and Soft Matter Physics. 78 (1), 041923 (2008).
- . Chemical modification of silicon surfaces for the application in soft lithography. Technical Report Juel-4249 Available from: https://www.osti.gov/etdeweb/biblio/21084355 (2007)
- Lim, K. B., Lee, D. C. Surface modification of glass and glass fibers by plasma surface treatment. Surface and Interface Analysis. 36, 254-258 (2004).
- Beal, J. H. L., Bubendorfer, A., Kemmitt, T., Hoek, I., Arnold, W. M. A rapid, inexpensive surface treatment for enhanced functionality of polydimethylsiloxane microfluidic channels. Biomicrifluidics. 6 (3), 36503 (2012).
- Goddard, J. M., Erickson, D. Bioconjugation techniques for microfluidic biosensors. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 394 (2), 469-479 (2009).
- Rajagopalan, P., et al. Direct comparison of the spread area, contractility, and migration of balb/c 3T3 fibroblasts adhered to fibronectin- and RGD-modified substrata. Biophysical Journal. 87 (4), 2818-2827 (2004).
- Tang, X., Yakut Ali, M., Saif, M. T. A. A novel technique for micro-patterning proteins and cells on polyacrylamide gels. Soft Matter. 8 (27), 3197-3206 (2012).
- Rape, A. D., Guo, W. H., Wang, Y. L. The regulation of traction force in relation to cell shape and focal adhesions. Biomaterials. 32 (8), 2043-2051 (2010).
- Rusmini, F., Zhong, Z., Feijen, J. Protein immobilization strategies for protein biochips. Biomacromolecules. 8 (6), 1775-1789 (2007).
- Polio, S. R., et al. A micropatterning and image processing approach to simplify measurement of cellular traction forces. Acta Biomaterialia. 8 (1), 82-88 (2012).
- Buxboim, A., et al. How deeply cells feel: methods for thin gels. Journal of Physics: Condensed Matter. 22 (19), 194116 (2010).
- Xu, H., et al. Focal adhesion displacement magnitude is a unifying feature of tensional homeostasis. Acta Biomaterialia. 113, 327-379 (2020).
- Shen, K., et al. Micropatterning of costimulatory ligands enhances CD4+ T cell function. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (22), 7791-7796 (2008).
- Eichinger, C. D., Hsiao, T. W., Hlady, V. Multiprotein microcontact printing with micrometer resolution. Langmuir. 28 (4), 2238-2243 (2012).
- Shen, K., Qi, J., Kam, L. C. Microcontact printing of proteins for cell biology. Journal of Visualized Experiments:JoVE. (22), e1065 (2008).
- Zollinger, A. J., et al. Dependence of tensional homeostasis on cell type and on cell-cell interactions. Cellular and Molecular Bioengineering. 11 (3), 175-184 (2018).
- Xia, Y. N., Whitesides, G. M. Extending microcontact printing as a microlithographic technique. Langmuir. 13 (7), 2059-2067 (1997).
- Ruiz, S. A., Chen, C. S. Microcontact printing: A tool to pattern. Soft Matter. 3 (2), 168-177 (2007).
- Rottmar, M., et al. Stem cell plasticity, osteogenic differentiation and the third dimension. Journal of Materials Science-Materials in Medicine. 21 (3), 999-1004 (2010).
- Desai, R. A., et al. Subcellular spatial segregation of integrin subtypes by patterned multicomponent surfaces. Integrative Biology. 3 (5), 560-567 (2011).
- Kim, S. H., Lee, S., Ahn, D., Park, J. Y. PDMS double casting method enabled by plasma treatment and alcohol passivation. Sensors and Actuators B: Chemical. 293, 115-121 (2019).
- Butler, J. P., Tolić-Nǿrrelykke, I. M., Fabry, B., Fredberg, J. J. Traction fields, moments, and strain energy that cells exert on their surroundings. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 282 (3), 595-605 (2002).
- Canović, E. P., et al. Biomechanical imaging of cell stiffness and prestress with subcellular resolution. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 13 (3), 665-678 (2014).
- Stamenović, D., Smith, M. L. Tensional homeostasis at different length scales. Soft Matter. 16 (30), 6946-6963 (2020).
