יצירת תבניות למיקרוסקופיית מתיחה מיקרופטרן

Summary

אנו מתארים שיפורים בשיטה סטנדרטית למדידת כוחות המתיחה התאית, המבוססת על הדפסה מיקרו-קונטרקטית עם שלב דפוס תת-קרקעי יחיד של מערכי נקודות של חלבוני מטריצה חוץ-תאית על הידרוג’לים רכים. שיטה זו מאפשרת ייצור פשוט ועקבי יותר של דפוסי איים, החיוניים לשליטה בצורת צביר התאים.

Abstract

מיקרוסקופיית מתיחה מיקרו-פטרן מאפשרת שליטה על הצורה של תאים בודדים ואשכולות תאים. יתר על כן, היכולת לעצב בסולם אורך המיקרומטר מאפשרת שימוש באזורי מגע מעוצבים אלה למדידת כוחות מתיחה, שכן כל נקודה מיקרו-פטרנטית מאפשרת היווצרות של הידבקות מוקדית אחת המעוותת את ההידרוג’ל הרך והבסיסי. גישה זו שימשה למגוון רחב של סוגי תאים, כולל תאי אנדותל, תאי שריר חלקים, פיברובלסטים, טסיות דם ותאי אפיתל.

סקירה זו מתארת את האבולוציה של טכניקות המאפשרות הדפסה של חלבוני מטריצה חוץ-תאית על הידרוג’לים של פוליאקרילאמיד במערך קבוע של נקודות בגודל ובמרווחים שצוינו מראש. מכיוון שקשה להדפיס תבניות בקנה מידה של מיקרומטר ישירות על מצעים רכים, התבניות נוצרות תחילה על כיסויי זכוכית קשיחים המשמשים לאחר מכן להעברת התבנית להידרוג’ל במהלך הג’לציה. ראשית, מתוארת גישת ההדפסה המיקרו-קונטגטית המקורית ליצירת מערכים של נקודות קטנות על הכיסוי. צעד שני שמסיר את רוב התבנית כדי להשאיר איים של נקודות קטנות נדרש כדי לשלוט בצורות של תאים ואשכולות תאים על מערכים כאלה של נקודות מעוצבות.

לאחר מכן, מתוארת אבולוציה של גישה זו המאפשרת יצירת איים של נקודות באמצעות שלב דפוס תת-קרקעי יחיד. גישה זו היא פשוטה מאוד עבור המשתמש, אבל יש את החיסרון של אורך חיים מופחת עבור תבנית האב הדרושה כדי ליצור את הדפוסים. לבסוף, מתוארות הגישות החישוביות שפותחו לניתוח תמונות של נקודות שנעקרו ושדות מתיחה שנוצרו לאחר מכן על ידי תאים, וגרסאות מעודכנות של חבילות ניתוח אלה מסופקות.

Introduction

רוב הפנוטיפים של התא מפעילים כוחות אחיזה על סביבתם. כוחות מתיחה אלה נוצרים על ידי שלד הציטוסקלטון המתכווץ של התא, שהוא רשת של אקטין ומיוזין, וביופולימרים נימיים אחרים וחלבונים צולבים ^1,2,3,4. כוחות הנוצרים בתוך התא יכולים להיות מועברים לסביבה החוץ-תאית או לתאים הסמוכים, בעיקר באמצעות חלבוני טרנס-ממברנה כגון אינטגרין וקדרינים, בהתאמה ^5,6. האופן שבו תא מתפשט או מתכווץ – וגודל כוחות המתיחה הקשורים לתנועות אלה – הוא תוצאה של שיחה אינטימית עם סביבתו, התלויה במידה רבה בסוג ובכמות החלבון הקיימים במטריצה החוץ-תאית (ECM)^7,8 ובנוקשות של ה-ECM. ואכן, מיקרוסקופיית כוח המתיחה הפכה לכלי שלא יסולא בפז להבנת היענות התאים לגירויים מקומיים כגון נוקשות המצע, לחצים מכניים ומוטלים על מתחים, או מגע עם תאים אחרים. מידע זה רלוונטי ישירות להבנת מחלות כגון סרטן ואסתמה ^9,10,11,12.

מערכת שיכולה לשמש למדידת דפורמציה המושרה בכוח של מצע של תכונות חומר ידועות נדרשת כדי לחשב את כוחות המתיחה. יש לעקוב אחר שינויים אלה לאורך זמן, הדורשים הן טכניקות הדמיה והן טכניקות עיבוד תמונה. אחת השיטות הראשונות ששימשו לקביעת כוחות המתיחה התאית הייתה תצפית וניתוח של התכווצות של קולגן הידרוג’לים שנזרעו בתאים, אם כי שיטה זו הייתה רק סמי-קוונטיטיבית¹³. שיטה אחרת, מעודנת יותר, הייתה למדוד את כוחות המתיחה המופעלים על ידי תאים בודדים על ידי קביעת הכוחות הנובעים מעיוות של יריעה דקה של סיליקון¹⁴. בהמשך פותחו טכניקות מדידה כמותיות נוספות, ושיטות אלה אפשרו גם שימוש בהידרוג’לים רכים כגון פוליאקרילאמיד (PAA)12,15,16. בעת שימוש בחומרים רכים אלה, ניתן היה לקבוע את כוחות המתיחה מתוך תזוזה המושרה בכוח של חרוזים שנעקרו באופן אקראי המוטמעים בהידרוג’ל והתכונות המכניות של הג’ל^16,17. התקדמות נוספת הגיעה עם פיתוח מערכי מיקרופוסטים העשויים מפולידימתילסילוקסן רך (PDMS) כך שניתן יהיה למדוד את סטייתם ולהמירם לכוח באמצעות תורת הקרן¹⁸.

לבסוף, פותחו שיטות למיקרו-פטרינג הידרוג’לים רכים מכיוון שגישות אלה מאפשרות שליטה על אזורי המגע להדבקת תאים. על ידי מדידת העיוות של המיקרו-פטרן בתוך אזור המגע של התא, ניתן היה לחשב בקלות את כוחות המתיחה מכיוון שאין צורך בתמונת ייחוס נטולת כוח¹⁹. שיטה זו אומצה באופן נרחב מכיוון שהיא מאפשרת דפוס עקיף של מערך קבוע של נקודות הידבקות חלבונים פלואורסצנטיים בדידים בגודל מיקרון על ג’לים PAA למדידת כוחות המתיחה התאית²⁰. כדי לחשב את הכוחות האלה, פותח אלגוריתם לעיבוד תמונה, שיכול לעקוב אחר התנועות של כל נקודה מיקרו-פטרית ללא צורך בקלט משתמש,²¹.

בעוד ששיטה זו פשוטה ליצירת רשתות שלמות של תבניות נקודות, היא מורכבת יותר כאשר רוצים תבניות של טלאים מבודדים (או איים) של נקודות. איים זעירים שימושיים כאשר יש צורך בשליטה על הצורה, ובמידה מסוימת של גודל, של אשכולות של תאים. כדי ליצור איים אלה, השיטה הנ”ל של הדפסת מיקרו-קונטיקט מחייבת שני שלבים נפרדים: i) שימוש בחותמת PDMS אחת כדי ליצור תבנית של נקודות בנאמנות גבוהה על מכסה, ולאחר מכן ii) שימוש בחותמת PDMS שונה שנייה כדי להסיר את רוב הנקודות הללו, תוך השארת איים מבודדים של נקודות²¹. הקושי ביצירת איים בשיטה מקורית זו מתווסף לעובדה שיצירת תבניות רשת עקביות בשלב הראשון של התהליך היא מאתגרת בפני עצמה. בולי מיקרו-הדפסה מורכבים ממערך של מיקרו-עמודים עגולים, שקוטרם מתאים לגודל הנקודה הרצוי. לאחר מכן מצופים בולים אלה בשכבה אחידה של חלבון ולאחר מכן מוטבעים בלחץ מדויק על כיסויים מטופלים כדי ליצור את התבנית הרצויה. מצד אחד, הפעלת לחץ רב מדי על החותמת עלולה לגרום להעברת חלבונים לא אחידה ולנאמנות דפוס לקויה עקב אבזם עמודים או נפול בין עמודים, מה שמוביל למגע עם הזכוכית. מצד שני, הפעלת לחץ נמוך מדי גורמת להעברת חלבון מועטה עד אפסית ולנאמנות דפוסים ירודה. מסיבות אלה, רצוי תהליך העברה שניתן להשתמש בו כדי ליצור באופן עקבי מיקרו-פטרנים באיכות גבוהה של איים מבודדים של נקודות בשלב אחד בלבד.

כאן מתוארת שיטה למיקרו-פטרציה עקיפה של איים של נקודות הידבקות חלבונים פלואורסצנטיים בגודל מיקרון על ג’ל PAA שהוא עקבי ורב-תכליתי יותר משיטות שפותחו בעבר. בעוד ששיטות מיקרו-פטרינג עקיפות ישנות יותר מסתמכות על העברת תבניות חלבונים מחותמת PDMS למצע ביניים, השיטה שהוצגה כאן משתמשת בחותמות PDMS במקום זאת ככלי להסרת חלבונים, לא כתוספת. זה נעשה על ידי שינוי יסודי הראשון של המבנה של חותמות PDMS בשימוש. במקום ליצור בולים המורכבים מתבנית של עמודים עגולים במרווחים שווים, הבולים מורכבים מתבנית של חורים עגולים במרווחים שווים בשיטה זו.

עם מבנה חדש זה, ניתן לטפל במשטח של חותמות PDMS אלה באמצעות גלוטארלדהיד כפי שתואר קודם לכן^20,29,30, מה שהופך את החותמת מסוגלת להיקשר באופן קוולנטי עם חלבון. כאשר משתמשים בהם על כיסוי זכוכית המצופה באופן שווה בחלבון פלואורסצנטי, חותמות PDMS אלה, שטופלו בגלוטרלדהיד, משמשות להסרת רוב החלבון על פני השטח של הכיסוי, ומותירות אחריהן רק את התבנית הרצויה של נקודות שנקבעו מראש על ידי מיקום החורים בגודל מיקרון על החותמת. שינוי זה מגדיל את שיעור ההצלחה ביצירת תבניות המורכבות מרשת כמעט רציפה של נקודות וביצירת איים מבודדים של נקודות באמצעות צעד אחד בלבד.

Protocol

1. יצירת מאסטרים של סיליקון הערה: רוב התהליך של העיצוב, היצירה ופתרון הבעיות של מאסטרים של סיליקון עבור יציקה חוזרת ונשנית של חותמות PDMS כוסה בעבר21, כך שרק הבדלים מרכזיים בגישה חדשה זו יתוארו כאן. צור את העיצוב עבור מסיכת הצילום באמצעות AutoCAD או תוכנת…

Representative Results

הידרוג’לים של PAA עם המודולוס של יאנג של E = 3.6 kPa והיחס של פואסון של ν = 0.445 נעשו לשימוש על ידי שיטת מיקרו-פטרינג תת-קרקעית זו. ההידרוג’לים יוצרו בעובי של כ-100 מיקרומטר, מה שמאפשר להם להיות מצטלם עם מערך ההדמיה שבו נעשה שימוש כאן, תוך מניעת חדירת התאים לכיסוי הנוקשה שמתחת לג’ל, מה שיגרום ל?…

Discussion

שיטה משופרת לדפוס עקיף של הידרוג’לים של PAA מתוארת במאמר זה. גישה זו מתבססת על שיטות ששימשו בעבר 20,35,36,37,38,39,40,41,42. השינוי העיקר…

Materials

(3-aminopropyl)trimethoxysilane	Sigma Aldrich	#281778
1.5 mL Microcentrifuge tube	Fisher Scientific	#05-408-129
15 mL conical tube	Fisher Scientific	#05-539-12
4 x 4 in 0.060 Quartz LR Chrome Photomask	Advance Reproductions Corporation	N/A	Custom-designed mask
6 Well Plates	Fisher Scientific	#07-200-83
Acetone	Fisher Scientific	#A18P-4
Acrylamide Solution, 40%	Sigma Aldrich	#A4058
AlexaFluor 488	Thermo Fisher	#A20000
Aminonium Persulfate	Fisher Scientific	#BP179-25
Bisacrylamide	Fisher Scientific	#PR-V3141
Ethanol	Greenfield Global	#111000200C1GL
Glass Coverslips, 25 mm round	Fisher Scientifc	#12-545-102
Glass Coverslips, 30 mm round	Warner	#64-1499
Hamamatsu ORCA-R2 Camera	Hamamatsu	#C10600-10B
Human Plasma	Valley Biomedical	#HP1051P	Used to isolate fibronectin
Hydrochloric Acid, 1.0 N	Millipore Sigma	#1.09057
ImageJ	Wayne Rasband	#1.53n
Interchangeable Coverslip Dish Set	Bioptechs	#190310-35
Kim Wipes	Fisher Scientific	#06-666-11C
Mask Alinger	Karl Suss	#MA6
Matlab 2021	Mathworks	#R2021a
MetaMorph Basic	Molecular Devices	#v7.7.1.0
N-hydroxysuccinimide ester	Sigma Aldrich	#130672-5G
NucBlue Live Cell Stain	Thermo Fisher	#R37605
Olympus IX2-ZDC Inverted Microscope	Olympus	#IX81
PD-10 Desalting Columns	GE Healthcare	#52-1308-00
Photoresist Spinner Hood	Headway Research	#PWM32
Plasma Cleaner	Harrick	#PDC-001
Plasma Etcher	TePla	#M4L
Prior Lumen 200Pro Light Source	Prior Scientific	#L200
Silicon Wafers, 100 mm	University Wafer	#809
SU-8 2005	Kayaku Advanced Materials Inc.	#NC9463827
SU-8 Developer	Kayaku Advanced Materials Inc.	#NC9901158
Sylgard 184 Silicone Elastomer	Essex Brownell	#DC-184-1.1
Tetramethylethylenediamine	Fisher Scientific	#BP150-20
Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane	Sigma Aldrich	#448931
UAPON-40XW340 Objective	Olympus	#N2709300
UV Flood Exposure	Newport	#69910
Wafer Carrier Tray, 110 x 11 mm	Ted Pella, Inc.	#19395-40