Mønstergenerering for mikropattern trekkraftmikroskopi

Summary

Vi beskriver forbedringer av en standardmetode for måling av cellulære trekkraftkrefter, basert på mikrokontakttrykk med et enkelt subtraktivt mønstertrinn av punktmatriser av ekstracellulære matriseproteiner på myke hydrogeler. Denne metoden gir enklere og mer konsistent fabrikasjon av øymønstre, avgjørende for å kontrollere celleklyngeform.

Abstract

Micropattern trekkraft mikroskopi gir kontroll over formen på enkeltceller og celleklynger. Videre tillater evnen til å mønstre på mikrometerlengdeskalaen bruk av disse mønstrede kontaktsonene for måling av trekkraftkrefter, da hver mikropatterned prikk tillater dannelse av en enkelt fokal vedheft som deretter deformerer den myke, underliggende hydrogelen. Denne tilnærmingen har blitt brukt til et bredt spekter av celletyper, inkludert endotelceller, glatte muskelceller, fibroblaster, blodplater og epitelceller.

Denne gjennomgangen beskriver utviklingen av teknikker som tillater utskrift av ekstracellulære matriseproteiner på polyakrylamidhydrgeler i et vanlig utvalg av prikker av forhåndsspesifisert størrelse og avstand. Siden mikrometerskalamønstre er vanskelige å skrive ut direkte på myke substrater, genereres mønstre først på stive glassdeksler som deretter brukes til å overføre mønsteret til hydrogelen under gelering. For det første er den opprinnelige mikrokontaktutskriftsmetoden for å generere matriser med små prikker på dekslene beskrevet. Et annet trinn som fjerner det meste av mønsteret for å forlate øyer med små prikker, er nødvendig for å kontrollere formene til celler og celleklynger på slike matriser med mønstrede prikker.

Deretter beskrives en utvikling av denne tilnærmingen som gjør det mulig for generering av øyer med prikker ved hjelp av et enkelt subtraktivt mønstertrinn. Denne tilnærmingen er sterkt forenklet for brukeren, men har ulempen med en redusert levetid for mesterformen som trengs for å lage mønstrene. Til slutt beskrives beregningsmetodene som er utviklet for analyse av bilder av fordrevne prikker og etterfølgende cellegenererte trekkraftfelt, og oppdaterte versjoner av disse analysepakkene er gitt.

Introduction

De fleste celle fenotyper utøver trekkraft krefter på deres miljø. Disse trekkraft kreftene genereres av en celles kontraktile cytoskeleton, som er et nettverk av aktin og myosin, og andre filamentøse biopolymerer og krysskoblingsproteiner 1,2,3,4. Krefter generert i cellen kan overføres til det ekstracellulære miljøet eller tilstøtende celler, hovedsakelig via transmembranproteiner som integriner og kaderiner, henholdsvis ^5,6. Hvordan en celle sprer seg eller trekker seg sammen – og størrelsen på trekkraftkreftene knyttet til disse bevegelsene – er resultatet av en intim samtale med miljøet, som i stor grad avhenger av type og mengde protein som er tilstede i den ekstracellulære matrisen (ECM) ^7,8 og stivheten til ECM. Faktisk har trekkraftmikroskopi blitt et uvurderlig verktøy for å forstå cellerespons på lokale stimuli som substratstivhet, pålagt mekaniske belastninger og stammer, eller kontakt med andre celler. Denne informasjonen er direkte relevant for forståelsen av sykdommer som kreft og astma 9,10,11,12.

Et system som kan brukes til å måle kraftindusert deformasjon av et substrat av kjente materialegenskaper, er nødvendig for å beregne trekkraftkrefter. Disse endringene må spores over tid, noe som krever både bilde- og bildebehandlingsteknikker. En av de første metodene som ble brukt for å bestemme cellulære trekkraftkrefter var observasjon og analyse av sammentrekningen av kollagenhydrgeler frøet med celler, selv om denne metoden bare var semikantiv¹³. En annen, mer raffinert metode var å måle trekkraftkreftene som utøves av enkeltceller ved å bestemme kreftene som følge av deformasjon av et tynt ark silikon¹⁴. Senere ble det utviklet mer kvantitative måleteknikker, og disse metodene tillot også bruk av myke hydrogeler som polyakrylamid (PAA) 12,15,16. Ved bruk av disse myke materialene kan trekkraftkrefter bestemmes fra den kraftinduserte forskyvningen av tilfeldig fordrevne perler innebygd i hydrogelen og gelens mekaniske egenskaper^16,17. Et annet fremskritt kom med utviklingen av mikropostmatriser laget av myk polydimetylsiloksan (PDMS) slik at deres avbøyning kunne måles og konverteres til kraft ved hjelp av stråleteorien¹⁸.

Til slutt ble metoder for mikropatterning av myke hydrogeler utviklet da disse tilnærmingene tillater kontroll av kontaktområdene for celleadhesjon. Ved å måle deformasjonen av mikropatternen i en celles kontaktområde, kan trekkraftkrefter enkelt beregnes fordi et kraftfritt referansebilde ikke er nødvendig¹⁹. Denne metoden har blitt allment vedtatt da den tillater indirekte mønster av et vanlig utvalg av mikron-størrelse, diskret fluorescerende proteinadhesjonspunkter på PAA geler for måling av cellulære trekkraftkrefter²⁰. For å beregne disse kreftene er^{det utviklet en} bildebehandlingsalgoritme, som kan spore bevegelsene til hver mikropatterned prikk uten å kreve brukerinndata.

Selv om denne metoden er enkel for å lage hele rutenett med prikkmønstre, er det mer komplisert når mønstre av isolerte flekker (eller øyer) av prikker er ønsket. Mikropatterned øyer er nyttige når kontroll av form, og til en viss grad av størrelse, av klynger av celler er nødvendig. For å skape disse øyene, nødvendiggjør den nevnte metoden for mikrokontaktutskrift to forskjellige trinn: i) ved hjelp av ett PDMS-stempel for å lage et høygjengivelsesmønster av prikker på en coverlip, og deretter ii) ved hjelp av et annet annet PDMS-stempel for å fjerne de fleste av disse prikkene, og etterlater isolerte øyer med prikker²¹. Vanskeligheten med å skape øyer med denne opprinnelige metoden er sammensatt av det faktum at det er utfordrende å lage konsistente rutenettmønstre i det første trinnet i prosessen. Mikrotrykksstempler består av en rekke sirkulære mikroposter, hvis diameter tilsvarer ønsket punktstørrelse. Disse frimerkene er deretter belagt med et jevnt lag protein og deretter stemplet med en presis mengde trykk på behandlede deksler for å skape ønsket mønster. På den ene siden kan påføring av for mye trykk på stempelet føre til ujevn proteinoverføring og dårlig mønstergjengivelse på grunn av søylespenning eller sagging mellom søyler, noe som fører til kontakt med glasset. På den annen side resulterer det i lite eller ingen proteinoverføring og dårlig mønstergjengivelse å bruke for lite trykk. Av disse grunnene er det ønskelig med en overføringsprosess som konsekvent kan brukes til å lage mikropatterner av høy kvalitet av isolerte øyer med prikker på bare ett trinn.

Heri er en metode beskrevet for indirekte mikropattering av øyer av mikron-størrelse fluorescerende proteinadhesjonspunkter på en PAA gel som er mer konsistent og allsidig enn tidligere utviklede metoder. Mens eldre indirekte mikropatterningsmetoder er avhengige av overføring av proteinmønstre fra et PDMS-stempel til et mellomliggende substrat, bruker metoden som introduseres her PDMS-frimerker i stedet som et fartøy for proteinfjerning, ikke tillegg. Dette gjøres ved først å fundamentalt endre strukturen til PDMS-stemplene som brukes. I stedet for å lage frimerker som består av et mønster av jevnt fordelte sirkulære søyler, består frimerker av et mønster av jevnt fordelte sirkulære hull i denne metoden.

Med denne nye strukturen kan overflaten av disse PDMS-frimerkene deretter behandles med glutaraldehyd som beskrevet tidligere 20,29,30, noe som gjør stempelet i stand til å binde kovalent med protein. Når de brukes på et glassdeksler jevnt belagt med fluorescerende protein, brukes disse glutaraldehydbehandlede PDMS-frimerkene til å fjerne det meste av proteinet på overflaten av dekslene, og etterlater bare ønsket mønster av prikker forhåndsbestemt av plasseringen av mikronstore hull på stempelet. Denne endringen øker suksessraten for å generere mønstre som består av et nesten kontinuerlig rutenett av prikker og for å skape isolerte øyer med prikker gjennom bare ett trinn.

Protocol

1. Opprettelse av silikonmestere MERK: Det meste av prosessen med design, opprettelse og feilsøking av silisiummestere for gjentatt støping av PDMS-frimerker har blitt dekket tidligere21, så bare viktige forskjeller i denne nye tilnærmingen vil bli beskrevet her. Lag designet for fotomasken ved hjelp av AutoCAD eller lignende designprogramvare. Belegge den ene siden av fotomasken, et tynt stykke glass, med et tynt lag med krom for å kontr…

Representative Results

PAA hydrogeler med Youngs modulus av E = 3,6 kPa og Poissons forhold på ν = 0,445 ble laget for bruk ved hjelp av denne subtraktive mikropatteringsmetoden. Hydrogelene ble laget for å være ~ 100 μm tykke, noe som gjør at de kan avbildes med bildeoppsettet som brukes her, samtidig som de forhindrer cellene i å føle den stive dekslen under gelen, noe som vil føre til problemer i studier fokusert på cellulær stivhet sensing23,33. Geler a…

Discussion

En forbedret metode for indirekte mønster av PAA-hydrogeler er beskrevet i dette dokumentet. Denne tilnærmingen bygger på metoder som har blitt brukt tidligere 20,35,36,37,38,39,40,41,42. Den primære endringen er at PD…

Materials

(3-aminopropyl)trimethoxysilane	Sigma Aldrich	#281778
1.5 mL Microcentrifuge tube	Fisher Scientific	#05-408-129
15 mL conical tube	Fisher Scientific	#05-539-12
4 x 4 in 0.060 Quartz LR Chrome Photomask	Advance Reproductions Corporation	N/A	Custom-designed mask
6 Well Plates	Fisher Scientific	#07-200-83
Acetone	Fisher Scientific	#A18P-4
Acrylamide Solution, 40%	Sigma Aldrich	#A4058
AlexaFluor 488	Thermo Fisher	#A20000
Aminonium Persulfate	Fisher Scientific	#BP179-25
Bisacrylamide	Fisher Scientific	#PR-V3141
Ethanol	Greenfield Global	#111000200C1GL
Glass Coverslips, 25 mm round	Fisher Scientifc	#12-545-102
Glass Coverslips, 30 mm round	Warner	#64-1499
Hamamatsu ORCA-R2 Camera	Hamamatsu	#C10600-10B
Human Plasma	Valley Biomedical	#HP1051P	Used to isolate fibronectin
Hydrochloric Acid, 1.0 N	Millipore Sigma	#1.09057
ImageJ	Wayne Rasband	#1.53n
Interchangeable Coverslip Dish Set	Bioptechs	#190310-35
Kim Wipes	Fisher Scientific	#06-666-11C
Mask Alinger	Karl Suss	#MA6
Matlab 2021	Mathworks	#R2021a
MetaMorph Basic	Molecular Devices	#v7.7.1.0
N-hydroxysuccinimide ester	Sigma Aldrich	#130672-5G
NucBlue Live Cell Stain	Thermo Fisher	#R37605
Olympus IX2-ZDC Inverted Microscope	Olympus	#IX81
PD-10 Desalting Columns	GE Healthcare	#52-1308-00
Photoresist Spinner Hood	Headway Research	#PWM32
Plasma Cleaner	Harrick	#PDC-001
Plasma Etcher	TePla	#M4L
Prior Lumen 200Pro Light Source	Prior Scientific	#L200
Silicon Wafers, 100 mm	University Wafer	#809
SU-8 2005	Kayaku Advanced Materials Inc.	#NC9463827
SU-8 Developer	Kayaku Advanced Materials Inc.	#NC9901158
Sylgard 184 Silicone Elastomer	Essex Brownell	#DC-184-1.1
Tetramethylethylenediamine	Fisher Scientific	#BP150-20
Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane	Sigma Aldrich	#448931
UAPON-40XW340 Objective	Olympus	#N2709300
UV Flood Exposure	Newport	#69910
Wafer Carrier Tray, 110 x 11 mm	Ted Pella, Inc.	#19395-40