Mönstergenerering för mikromönsterdragelektronkopi

Summary

Vi beskriver förbättringar av en standardmetod för mätning av cellulära dragkrafter, baserad på mikrokontakttryck med ett enda subtraktivt mönstersteg av prickmatriser av extracellulära matrisproteiner på mjuka hydrogeler. Denna metod möjliggör enklare och mer konsekvent tillverkning av ömönster, vilket är viktigt för att kontrollera cellklusterformen.

Abstract

Mikromönsterdragmikroskopi möjliggör kontroll av formen på enskilda celler och cellkluster. Dessutom möjliggör förmågan att mönstra vid mikrometerlängdskalan användningen av dessa mönstrade kontaktzoner för mätning av dragkrafter, eftersom varje mikromönstrad prick möjliggör bildandet av en enda fokal vidhäftning som sedan deformerar den mjuka, underliggande hydrogelen. Detta tillvägagångssätt har använts för ett brett spektrum av celltyper, inklusive endotelceller, glattmuskelceller, fibroblaster, blodplättar och epitelceller.

Denna översyn beskriver utvecklingen av tekniker som möjliggör utskrift av extracellulära matrisproteiner på polyakrylamidhydrogeler i en regelbunden uppsättning prickar av förspecificerad storlek och avstånd. Eftersom mikrometerskalemönster är svåra att direkt skriva ut på mjuka underlag genereras mönster först på styva glasöverdrag som sedan används för att överföra mönstret till hydrogelen under gelering. Först beskrivs den ursprungliga mikrokontaktutskriftsmetoden för att generera matriser med små prickar på omslaget. Ett andra steg som tar bort det mesta av mönstret för att lämna öar av små prickar krävs för att kontrollera formerna på celler och cellkluster på sådana arrays av mönstrade prickar.

Därefter beskrivs en utveckling av detta tillvägagångssätt som möjliggör generering av öar av prickar med hjälp av ett enda subtraktivt mönstersteg. Detta tillvägagångssätt är mycket förenklat för användaren men har nackdelen med en minskad livslängd för huvudformen som behövs för att göra mönstren. Slutligen beskrivs de beräkningsmetoder som har utvecklats för analys av bilder av förskjutna prickar och efterföljande cellgenererade dragfält, och uppdaterade versioner av dessa analyspaket tillhandahålls.

Introduction

De flesta cellfenotyper utövar dragkrafter på sin miljö. Dessa dragkrafter genereras av en cells kontraktila cytoskelett, som är ett nätverk av aktin och myosin, och andra trådformiga biopolymerer och tvärbindningsproteiner 1,2,3,4. Krafter som genereras i cellen kan överföras till den extracellulära miljön eller intilliggande celler, främst via transmembranproteiner såsom integriner respektive kadheriner^{, 5,6}. Hur en cell sprider sig eller kontraherar – och storleken på dragkrafterna i samband med dessa rörelser – är resultatet av en intim konversation med sin miljö, som till stor del beror på typen och mängden protein som finns i den extracellulära matrisen (ECM)^7,8 och STYVHETEN HOS ECM. Faktum är att dragkraftmikroskopi har blivit ett ovärderligt verktyg för att förstå cellens lyhördhet för lokala stimuli som substratstyvhet, pålagda mekaniska spänningar och stammar eller kontakt med andra celler. Denna information är direkt relevant för förståelsen av sjukdomar som cancer och astma 9,10,11,12.

Ett system som kan användas för att mäta kraftinducerad deformation av ett substrat med kända materialegenskaper krävs för att beräkna dragkrafter. Dessa förändringar måste spåras över tid, vilket kräver både bildbehandling och bildbehandlingsteknik. En av de första metoderna som användes för att bestämma cellulära dragkrafter var observation och analys av sammandragningen av kollagenhydrogeler sådda med celler, även om denna metod endast var semikvantitativ¹³. En annan, mer förfinad metod var att mäta dragkrafterna som utövades av enskilda celler genom att bestämma krafterna som härrör från deformationen av ett tunt ark silikon¹⁴. Senare utvecklades mer kvantitativa mättekniker, och dessa metoder möjliggjorde också användning av mjuka hydrogeler såsom polyakrylamid (PAA)12,15,16. Vid användning av dessa mjuka material kunde dragkrafter bestämmas från den kraftinducerade förskjutningen av slumpmässigt förskjutna pärlor inbäddade i hydrogelen och gelens mekaniska egenskaper^16,17. Ett annat framsteg kom med utvecklingen av mikropostmatriser gjorda av mjuk polydimetylsiloxan (PDMS) så att deras avböjning kunde mätas och omvandlas till kraft med hjälp av strålteorin¹⁸.

Slutligen utvecklades metoder för mikromönstering av mjuka hydrogeler eftersom dessa metoder möjliggör kontroll av kontaktytorna för cellvidhäftning. Genom att mäta deformationen av mikromönstret inom en cells kontaktyta kan dragkrafter enkelt beräknas eftersom en kraftfri referensbild inte krävs¹⁹. Denna metod har antagits i stor utsträckning eftersom den möjliggör indirekt mönstran av en regelbunden uppsättning mikronstora, diskreta fluorescerande proteinvidhäftningspunkter på PAA-geler för mätning av cellulära dragkrafter²⁰. För att beräkna dessa krafter har en bildbehandlingsalgoritm, som kan spåra rörelserna för varje mikroförtunnad prick utan att kräva användarinmatning, utvecklats²¹.

Även om denna metod är enkel för att skapa hela rutnät av punktmönster, är det mer komplicerat när mönster av isolerade fläckar (eller öar) av prickar önskas. Mikromönsrade öar är användbara när kontroll av form, och till viss del av storlek, av kluster av celler behövs. För att skapa dessa öar kräver den ovannämnda metoden för mikrokontaktutskrift två distinkta steg: i) att använda en PDMS-stämpel för att skapa ett högkvalitativt mönster av prickar på en täckglas, och sedan ii) använda en andra annan PDMS-stämpel för att ta bort de flesta av dessa prickar och lämna isolerade öar av prickar²¹. Svårigheten att skapa öar med denna ursprungliga metod förvärras av det faktum att det är utmanande på egen hand att göra konsekventa rutmönster i processens första steg. Mikroutskriftsfrimärken består av en rad cirkulära mikrostolpar, vars diameter motsvarar önskad prickstorlek. Dessa frimärken beläggs sedan med ett jämnt lager protein och stämplas sedan med en exakt mängd tryck på behandlade täckglas för att skapa önskat mönster. Å ena sidan kan applicering av för mycket tryck på stämpeln resultera i ojämn proteinöverföring och dålig mönstertrohet på grund av pelarspännning eller sjunkande mellan pelare, vilket leder till kontakt med glaset. Å andra sidan resulterar applicering av för lite tryck i liten eller ingen proteinöverföring och dålig mönstertrohet. Av dessa skäl önskas en överföringsprocess som kan användas för att konsekvent skapa högkvalitativa mikromönster av isolerade öar av prickar i bara ett steg.

Här beskrivs en metod för indirekt mikromönstran av öar av mikronstora fluorescerande proteinvidhäftningspunkter på en PAA-gel som är mer konsekvent och mångsidig än tidigare utvecklade metoder. Medan äldre indirekta mikromönstranmetoder bygger på överföring av proteinmönster från en PDMS-stämpel till ett mellanliggande substrat, använder metoden som introduceras här PDMS-stämplar istället som ett kärl för proteinavlägsnande, inte tillsats. Detta görs genom att först fundamentalt ändra strukturen hos de PDMS-stämplar som används. I stället för att göra frimärken som består av ett mönster av jämnt fördelade cirkulära pelare, består frimärken av ett mönster av jämnt fördelade cirkulära hål i denna metod.

Med denna nya struktur kan ytan på dessa PDMS-stämplar sedan behandlas med glutaraldehyd som beskrivits tidigare 20,29,30, vilket gör att stämpeln kan binda kovalent med protein. När de används på en glasöverdragslip jämnt belagd med fluorescerande protein används dessa glutaraldehydbehandlade PDMS-stämplar för att avlägsna det mesta av proteinet på ytan av täckglaset, vilket endast lämnar det önskade mönstret av prickar förutbestämda av placeringen av mikronstora hål på stämpeln. Denna förändring ökar framgångsgraden för att generera mönster som består av ett nästan kontinuerligt rutnät av prickar och för att skapa isolerade öar av prickar genom bara ett steg.

Protocol

1. Skapande av silikonmästare OBS: Det mesta av processen med design, skapande och felsökning av kiselmästare för upprepad gjutning av PDMS-stämplar har täckts tidigare21, så endast viktiga skillnader i detta nya tillvägagångssätt kommer att beskrivas här. Skapa designen för fotomasken med AutoCAD eller liknande designprogramvara. Täck ena sidan av fotomasken, en tunn glasbit, med ett tunt lager krom för att kontrollera UV-ljussp…

Representative Results

PAA-hydrogeler med Youngs modul E = 3,6 kPa och Poissons förhållande ν = 0,445 gjordes för användning med denna subtraktiva mikromönstermetod. Hydrogelerna gjordes för att vara ~ 100 μm tjocka, vilket gör att de kan avbildas med den bildinställning som används här samtidigt som cellerna förhindras från att känna av den styva täckglaset under gelén, vilket skulle orsaka problem i studier fokuserade på cellulär styvhet som avkännar23,33<sup class="xre…

Discussion

En förbättrad metod för indirekt mönstrande PAA-hydrogeler beskrivs i detta dokument. Den här metoden bygger på metoder som har använts tidigare, dvs^. 20,35,36,37,38,39,40,41,42. Den primära förändringen är att …

Materials

(3-aminopropyl)trimethoxysilane	Sigma Aldrich	#281778
1.5 mL Microcentrifuge tube	Fisher Scientific	#05-408-129
15 mL conical tube	Fisher Scientific	#05-539-12
4 x 4 in 0.060 Quartz LR Chrome Photomask	Advance Reproductions Corporation	N/A	Custom-designed mask
6 Well Plates	Fisher Scientific	#07-200-83
Acetone	Fisher Scientific	#A18P-4
Acrylamide Solution, 40%	Sigma Aldrich	#A4058
AlexaFluor 488	Thermo Fisher	#A20000
Aminonium Persulfate	Fisher Scientific	#BP179-25
Bisacrylamide	Fisher Scientific	#PR-V3141
Ethanol	Greenfield Global	#111000200C1GL
Glass Coverslips, 25 mm round	Fisher Scientifc	#12-545-102
Glass Coverslips, 30 mm round	Warner	#64-1499
Hamamatsu ORCA-R2 Camera	Hamamatsu	#C10600-10B
Human Plasma	Valley Biomedical	#HP1051P	Used to isolate fibronectin
Hydrochloric Acid, 1.0 N	Millipore Sigma	#1.09057
ImageJ	Wayne Rasband	#1.53n
Interchangeable Coverslip Dish Set	Bioptechs	#190310-35
Kim Wipes	Fisher Scientific	#06-666-11C
Mask Alinger	Karl Suss	#MA6
Matlab 2021	Mathworks	#R2021a
MetaMorph Basic	Molecular Devices	#v7.7.1.0
N-hydroxysuccinimide ester	Sigma Aldrich	#130672-5G
NucBlue Live Cell Stain	Thermo Fisher	#R37605
Olympus IX2-ZDC Inverted Microscope	Olympus	#IX81
PD-10 Desalting Columns	GE Healthcare	#52-1308-00
Photoresist Spinner Hood	Headway Research	#PWM32
Plasma Cleaner	Harrick	#PDC-001
Plasma Etcher	TePla	#M4L
Prior Lumen 200Pro Light Source	Prior Scientific	#L200
Silicon Wafers, 100 mm	University Wafer	#809
SU-8 2005	Kayaku Advanced Materials Inc.	#NC9463827
SU-8 Developer	Kayaku Advanced Materials Inc.	#NC9901158
Sylgard 184 Silicone Elastomer	Essex Brownell	#DC-184-1.1
Tetramethylethylenediamine	Fisher Scientific	#BP150-20
Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane	Sigma Aldrich	#448931
UAPON-40XW340 Objective	Olympus	#N2709300
UV Flood Exposure	Newport	#69910
Wafer Carrier Tray, 110 x 11 mm	Ted Pella, Inc.	#19395-40