Studera ärftlig immunitet i en Caenorhabditis elegans-modell av mikrosporidiinfektion
Summary
Infektionen av Caenorhabditis elegans av den mikrosporidiska parasiten Nematocida parisii gör det möjligt för maskarna att producera avkommor som är mycket resistenta mot samma patogen. Detta är ett exempel på ärftlig immunitet, ett dåligt förstått epigenetiskt fenomen. Det föreliggande protokollet beskriver studien av ärftlig immunitet i en genetiskt dragbar maskmodell.
Abstract
Ärftlig immunitet beskriver hur vissa djur kan vidarebefordra “minnet” av en tidigare infektion till sina avkommor. Detta kan öka patogenresistensen hos deras avkomma och främja överlevnad. Medan ärftlig immunitet har rapporterats hos många ryggradslösa djur, är mekanismerna bakom detta epigenetiska fenomen i stort sett okända. Infektionen av Caenorhabditis elegans av den naturliga mikrosporidiska patogenen Nematocida parisii resulterar i att maskarna producerar avkommor som är robust resistenta mot mikrosporidier. Det föreliggande protokollet beskriver studiet av immunitet mellan generationer i den enkla och genetiskt lätthanterliga N. parisii –C. elegans-infektionsmodellen . Den aktuella artikeln beskriver metoder för att infektera C. elegans och generera immunprimerade avkommor. Metoder ges också för att analysera resistens mot mikrosporidiinfektion genom färgning för mikrosporidier och visualisering av infektion genom mikroskopi. I synnerhet förhindrar ärftlig immunitet värdcellinvasion av mikrosporidier, och fluorescens in situ hybridisering (FISH) kan användas för att kvantifiera invasionshändelser. Den relativa mängden mikrosporidier som produceras i de immunprimerade avkommorna kan kvantifieras genom att färga sporerna med ett kitinbindande färgämne. Hittills har dessa metoder belyst kinetiken och patogenspecificiteten hos ärftlig immunitet, liksom de molekylära mekanismerna bakom den. Dessa tekniker, tillsammans med de omfattande verktyg som finns tillgängliga för C. elegans forskning, kommer att möjliggöra viktiga upptäckter inom ärftlig immunitet.
Introduction
Ärftlig immunitet är ett epigenetiskt fenomen där föräldrarnas exponering för patogener kan möjliggöra produktion av infektionsresistenta avkommor. Denna typ av immunminne har visats hos många ryggradslösa djur som saknar adaptiva immunförsvar och kan skydda mot virus-, bakterie- och svampsjukdomar1. Medan ärftlig immunitet har viktiga konsekvenser för att förstå både hälsa och evolution, är de molekylära mekanismerna bakom detta skydd i stort sett okända. Detta beror delvis på att många av de djur där ärftlig immunitet har beskrivits inte är etablerade modellorganismer för forskning. Däremot drar studier i den transparenta nematoden Caenorhabditis elegans nytta av en omfattande genetisk och biokemisk verktygslåda 2,3, ett mycket kommenterat genom 4,5 och en kort generationstid. Faktum är att forskning i C. elegans har möjliggjort grundläggande framsteg inom områdena epigenetik och medfödd immunitet 6,7, och det är nu en etablerad modell för att studera immunminne 8,9.
Mikrosporidier är svamppatogener som infekterar nästan alla djur och orsakar dödliga infektioner hos immunförsvagade människor10. Infektion börjar när en mikrosporidispore injicerar eller “avfyrar” sitt cellulära innehåll (sporoplasm) i en värdcell med hjälp av en struktur som kallas ett polärt rör. Intracellulär replikation av parasiten resulterar i bildandet av meronter, som i slutändan differentieras till mogna sporer som kan lämna cellen11,12. Även om dessa parasiter är skadliga för både människors hälsa och livsmedelssäkerhet, finns det mycket kvar att lära sig om deras infektionsbiologi12. Nematocida parisii är en naturlig mikrosporidisk parasit som replikerar uteslutande i tarmcellerna hos maskar, vilket resulterar i minskad fecunditet och i slutändan döden. Infektionsmodellen N. parisii –C. elegans har använts för att visa: (1) autofagiens roll i patogenclearance13, (2) hur mikrosporidier kan lämna infekterade celler icke-lytiskt14, (3) hur patogener kan spridas från cell till cell genom att bilda syncytia15, (4) proteinerna N. parisii använder för att interagera med dess värd16, och (5) regleringen av det transkriptionella intracellulära patogensvaret (IPR)17, 18.
Protokoll för infektion av C. elegans beskrivs i det aktuella arbetet och kan användas för att avslöja den unika mikrosporidibiologin och dissekera värdens svar på infektion. Mikroskopin av fasta maskar färgade med det kitinbindande färgämnet Direct Yellow 96 (DY96) visar infektionsspridningen av kitinhaltiga mikrosporidier i hela tarmen. DY96-färgning möjliggör också visualisering av kitinhaltiga maskembryon för samtidig bedömning av maskens graviditet (förmåga att producera embryon) som en avläsning av värdkonditionen.
Nytt arbete har avslöjat att C. elegans infekterade med N. parisii producerar avkommor som är robust resistenta mot samma infektion19. Denna ärftliga immunitet varar en enda generation och är dosberoende, eftersom avkommor från mer infekterade föräldrar är mer resistenta mot mikrosporidier. Intressant nog är N. parisii-grundade avkommor också mer resistenta mot den bakteriella tarmpatogenen Pseudomonas aeruginosa, även om de inte är skyddade mot den naturliga patogenen Orsay-virus19. Det föreliggande arbetet visar också att immunprimerade avkommor begränsar värdcellsinvasion av mikrosporidier. Metoden beskriver också insamlingen av immunprimerade avkommor och hur FISH kan användas för att detektera N. parisii RNA i tarmceller för att analysera värdcellsinvasion och sporbränning20.
Tillsammans ger dessa protokoll en solid grund för att studera mikrosporidier och ärftlig immunitet i C. elegans. Förhoppningen är att framtida arbete i detta modellsystem kommer att möjliggöra viktiga upptäckter inom det framväxande området ärftlig immunitet. Dessa tekniker kommer sannolikt också att vara utgångspunkter för att undersöka mikrosporidiinducerad ärftlig immunitet hos andra värdorganismer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det föreliggande protokollet beskriver studien av mikrosporidier och ärftlig immunitet i en enkel och genetiskt dragbar N. parisii –C. elegans infektionsmodell .
Sporberedning är ett intensivt protokoll som vanligtvis ger tillräckligt med sporer för 6 månaders experiment, beroende på produktivitet24. Viktigt är att smittsamheten måste bestämmas för varje nytt spore “parti” innan den används för experimenten. På grund av variationen i smit…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi är tacksamma för Winnie Zhao och Yin Chen Wan för att ge användbara kommentarer till manuskriptet. Detta arbete stöddes av Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (Grant #522691522691).
Materials
| 2.0 mm zirconia beads | Biospec Products Inc. | 11079124ZX | |
| 10 mL syringe | Fisher Scientific | 1482613 | |
| 5 μm filter | Millipore Sigma | SLSV025LS | |
| Axio Imager 2 | Zeiss | – | Fluorescent microscope for imaging of DY96- and FISH- stained worms on microscope slides |
| Axio Zoom V.16 Fluorescence Stereo Zoom Microscope | Zeiss | – | For live imaging of fluorescent transgenic animals to visualize the IPR |
| Baked EdgeGARD Horizontal Flow Clean Bench | Baker | – | |
| Bead disruptor, Genie SI-D238 Analog Disruptor Genie Cell Disruptor, 120 V | Global Industrial | T9FB893150 | |
| Cell-VU slide, Millennium Sciences Disposable Sperm Count Cytometers | Fisher Scientific | DRM600 | |
| Direct Yellow 96 | Sigma-Aldrich | S472409-1G | |
| EverBrite Mounting Medium with DAPI | Biotium | 23001 | |
| EverBrite Mounting Medium without DAPI | Biotium | 23002 | |
| Fiji/ImageJ software | ImageJ | https://imagej.net/software/fiji/downloads | |
| Mechanical rotor | Thermo Sceintific | 415110 / 1834090806873 | Used to spin tubes of bleached embryos for overnight hatching |
| MicroB FISH probe | Biosearch Technologies Inc. | – | Synthesized with a Quasar 570 (Cy3) 5' modification and HPLC purified, CTCTCGGCACTCCTTCCTG |
| N2 | Wild-type, Bristol strain | Default strain | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | L3771-100G | |
| Sodium hydroxide solution (5 N) | Fisher Chemical | FLSS256500 | |
| Sodium hypochlorite solution (6%) | Fisher Chemical | SS290-1 | |
| Stemi 508 Stereo Microscope | Zeiss | – | For daily maintenance of worms and counting of L1 worms for assay set ups |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P1379-100ML | |
| Vectashield + A16 | Biolynx | VECTH1500 |
Riferimenti
- Tetreau, G., Dhinaut, J., Gourbal, B., Moret, Y. Trans-generational immune priming in invertebrates: current knowledge and future prospects. Frontiers in Immunology. 10, 1938 (2019).
- Au, V., et al. CRISPR/Cas9 methodology for the generation of knockout deletions in Caenorhabditis elegans. G3 Genes|Genomes|Genetics. 9 (1), 135-144 (2019).
- Kamath, R. Genome-wide RNAi screening in Caenorhabditis elegans. Methods. 30 (4), 313-321 (2003).
- The C. elegans Sequencing Consortium. Genome sequence of the nematode C. elegans: a platform for investigating biology. Science. 282 (5396), 2012-2018 (1998).
- Yoshimura, J., et al. Recompleting the Caenorhabditis elegans genome. Genome Research. 29, 1009-1022 (2019).
- Weinhouse, C., Truong, L., Meyer, J. N., Allard, P. Caenorhabditis elegans as an emerging model system in environmental epigenetics: C. elegans as an environmental epigenetics model. Environmental and Molecular Mutagenesis. 59 (7), 560-575 (2018).
- Ermolaeva, M. A., Schumacher, B. Insights from the worm: the C. elegans model for innate immunity. Seminars in Immunology. 26 (4), 303-309 (2014).
- Willis, A. R., Sukhdeo, R., Reinke, A. W. Remembering your enemies: mechanisms of within-generation and multigenerational immune priming in Caenorhabditis elegans. TheFEBS Journal. 288 (6), 1759-1770 (2020).
- Burton, N. O., et al. Cysteine synthases CYSL-1 and CYSL-2 mediate C. elegans heritable adaptation to P. vranovensis infection. Nature Communications. 11, 1741 (2020).
- Wadi, L., Reinke, A. W. Evolution of microsporidia: an extremely successful group of eukaryotic intracellular parasites. PLoS Pathogens. 16, 1008276 (2020).
- Han, B., Takvorian, P. M., Weiss, L. M. Invasion of host cells by microsporidia. Frontiers in Microbiology. 11, 172 (2020).
- Tamim El Jarkass, H., Reinke, A. W. The ins and outs of host-microsporidia interactions during invasion, proliferation and exit. Cellular Microbiology. 22 (11), 13247 (2020).
- Balla, K. M., Lažetić, V., Troemel, E. R. Natural variation in the roles of C. elegans autophagy components during microsporidia infection. PLoS ONE. 14, 0216011 (2019).
- Szumowski, S. C., Estes, K. A., Troemel, E. R. Preparing a discreet escape: Microsporidia reorganize host cytoskeleton prior to non-lytic exit from C. elegans intestinal cells. Worm. 1 (4), 207-211 (2012).
- Balla, K. M., Luallen, R. J., Bakowski, M. A., Troemel, E. R. Cell-to-cell spread of microsporidia causes Caenorhabditis elegans organs to form syncytia. Nature Microbiology. 1 (11), 1-6 (2016).
- Reinke, A. W., Balla, K. M., Bennett, E. J., Troemel, E. R. Identification of microsporidia host-exposed proteins reveals a repertoire of rapidly evolving proteins. Nature Communications. 8, 14023 (2017).
- Bakowski, M. A., et al. Ubiquitin-mediated response to microsporidia and virus infection in C. elegans. PLoS Pathogen. 10, 1004200 (2014).
- Reddy, K. C., et al. An intracellular pathogen response pathway promotes proteostasis in C. elegans. Current Biology. 27 (22), 3544-3553 (2017).
- Willis, A. R., et al. A parental transcriptional response to microsporidia infection induces inherited immunity in offspring. Science Advances. 7 (19), (2021).
- Tamim El Jarkass, H., et al. An intestinally secreted host factor promotes microsporidia invasion of C. elegans. eLife. 11, 72458 (2022).
- Solis, G. M., Petrascheck, M. Measuring Caenorhabditis elegans life span in 96 well microtiter plates. Journal of Visualized Experiments. 49, 2496 (2011).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , (2006).
- Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. Measuring Caenorhabditis elegans life span on solid media. Journal of Visualized Experiments. (27), e1152 (2009).
- Estes, K. A., Szumowski, S. C., Troemel, E. R. Non-lytic, actin-based exit of intracellular parasites from C. elegans intestinal cells. PLOS Pathogens. 7, 1002227 (2011).
- Botts, M. R., Cohen, L. B., Probert, C. S., Wu, F., Troemel, E. R. Microsporidia intracellular development relies on myc interaction network transcription factors in the host. G3 Genes|Genomes|Genetics. 6 (9), 2707-2716 (2016).
- Corsi, A. K. A Transparent window into biology: A primer on Caenorhabditis elegans. WormBook. , 1-31 (2015).
- Rivera, D. E., Lažetić, V., Troemel, E. R., Luallen, R. J. RNA fluorescence in situ hybridization (FISH) to visualize microbial colonization and infection in the Caenorhabditis elegans intestines. bioRxiv. , (2022).
- Zhang, G., et al. A large collection of novel nematode-infecting microsporidia and their diverse interactions with Caenorhabditis elegans and other related nematodes. PLoS Pathogens. 12, 1006093 (2016).
- Luallen, R. J., et al. Discovery of a natural microsporidian pathogen with a broad tissue tropism in Caenorhabditis elegans. PLoS Pathogens. 12, 1005724 (2016).
- Troemel, E. R., Félix, M. -. A., Whiteman, N. K., Barrière, A., Ausubel, F. M. Microsporidia are natural intracellular parasites of the nematode Caenorhabditis elegans. PLoS Biology. 6, 309 (2008).
- Burton, N. O., et al. Intergenerational adaptations to stress are evolutionarily conserved, stress-specific, and have deleterious trade-offs. eLife. 10, 73425 (2021).
- Jaroenlak, P., et al. 3-Dimensional organization and dynamics of the microsporidian polar tube invasion machinery. PLoS Pathogens. 16, 1008738 (2020).
- Weidner, E., Manale, S. B., Halonen, S. K., Lynn, J. W. Protein-membrane interaction is essential to normal assembly of the microsporidian spore invasion tube. The Biological Bulletin. 188 (2), 128-135 (1995).
