Caenorhabditis elegans Mikrosporidia Enfeksiyonu Modelinde Kalıtsal Bağışıklığın İncelenmesi
Summary
Caenorhabditis elegans’ın mikrosporidian parazit Nematocida parisii tarafından enfeksiyonu, solucanların aynı patojene karşı oldukça dirençli yavrular üretmesini sağlar. Bu, kötü anlaşılmış bir epigenetik fenomen olan kalıtsal bağışıklığın bir örneğidir. Mevcut protokol, genetik olarak izlenebilir bir solucan modelinde kalıtsal bağışıklığın incelenmesini açıklamaktadır.
Abstract
Kalıtsal bağışıklık, bazı hayvanların önceki bir enfeksiyonun “hafızasını” yavrularına nasıl geçirebileceğini açıklar. Bu, soylarındaki patojen direncini artırabilir ve hayatta kalmayı teşvik edebilir. Birçok omurgasızda kalıtsal bağışıklık bildirilmiş olsa da, bu epigenetik fenomenin altında yatan mekanizmalar büyük ölçüde bilinmemektedir. Caenorhabditis elegans’ın doğal mikrosporidian patojen Nematocida parisii tarafından enfeksiyonu, mikrosporidiaya karşı sağlam dirençli yavrular üreten solucanlarla sonuçlanır. Bu protokol, basit ve genetik olarak izlenebilir N. parisii –C. elegans enfeksiyon modelinde nesiller arası bağışıklık çalışmasını açıklamaktadır. Bu makalede, C. elegans’ı enfekte etme ve bağışıklık astarlı yavrular üretme yöntemleri açıklanmaktadır. Mikrosporidia için boyama yaparak mikrosporidia enfeksiyonuna direnci arttırmak ve mikroskopi ile enfeksiyonu görselleştirmek için yöntemler de verilmektedir. Özellikle, kalıtsal bağışıklık, mikrosporidia tarafından konakçı hücre invazyonunu önler ve invazyon olaylarını ölçmek için floresan in situ hibridizasyon (FISH) kullanılabilir. Bağışıklık astarlı yavrularda üretilen mikrosporidia sporlarının nispi miktarı, sporların kitin bağlayıcı bir boya ile boyanmasıyla ölçülebilir. Bugüne kadar, bu yöntemler kalıtsal bağışıklığın kinetiği ve patojen özgüllüğünün yanı sıra bunun altında yatan moleküler mekanizmalara ışık tutmuştur. Bu teknikler, C. elegans araştırması için mevcut kapsamlı araçların yanı sıra, kalıtsal bağışıklık alanında önemli keşifler sağlayacaktır.
Introduction
Kalıtsal bağışıklık, ebeveynlerin patojenlere maruz kalmasının enfeksiyona dirençli yavruların üretimini sağlayabileceği epigenetik bir olgudur. Bu tip bağışıklık hafızası, adaptif bağışıklık sistemlerinden yoksun olan ve viral, bakteriyel ve fungal hastalıklara karşı koruma sağlayabilen birçok omurgasızda gösterilmiştir1. Kalıtsal bağışıklığın hem sağlığı hem de evrimi anlamak için önemli etkileri olsa da, bu korumanın altında yatan moleküler mekanizmalar büyük ölçüde bilinmemektedir. Bunun nedeni kısmen, kalıtsal bağışıklığın tanımlandığı hayvanların çoğunun, araştırma için kurulmuş model organizmalar olmamasıdır. Buna karşılık, şeffaf nematod Caenorhabditis elegans’taki çalışmalar, kapsamlı bir genetik ve biyokimyasal araç seti 2,3, yüksek açıklamalı bir genom 4,5 ve kısa bir üretim süresinden yararlanmaktadır. Gerçekten de, C. elegans’taki araştırmalar, epigenetik ve doğuştan gelen bağışıklık6,7 alanlarında temel ilerlemeler sağlamıştır ve şimdi bağışıklık hafızasını incelemek için kurulmuş bir model 8,9.
Mikrosporidia, hemen hemen tüm hayvanları enfekte eden ve bağışıklık sistemi baskılanmış insanlarda ölümcül enfeksiyonlara neden olan mantar patojenleridir10. Enfeksiyon, bir mikrosporidia sporu, hücresel içeriğini (sporoplazma) polar tüp adı verilen bir yapı kullanarak konakçı hücreye enjekte ettiğinde veya “ateşlediğinde” başlar. Parazitin hücre içi replikasyonu, sonuçtahücre 11,12’den çıkabilen olgun sporlara farklılaşan merontların oluşumuna neden olur. Bu parazitler hem insan sağlığına hem de gıda güvenliğine zararlı olsa da, enfeksiyon biyolojileri hakkında hala öğrenilecek çok şey var12. Nematocida parisii, yalnızca solucanların bağırsak hücrelerinde çoğalan ve doğurganlığın azalmasına ve nihayetinde ölüme neden olan doğal bir mikrosporidian parazittir. N. parisii-C. elegans enfeksiyon modeli şunları göstermek için kullanılmıştır: (1) patojen klirensinde otofajinin rolü13, (2) mikrosporidia’nın enfekte hücrelerden litik olmayan bir şekilde nasıl çıkabileceği 14, (3) patojenlerin sinsiti oluşturarak hücreden hücreye nasıl yayılabileceği 15, (4) N. parisii’nin konakçısı16 ile arayüz oluşturmak için kullandığı proteinler ve (5) transkripsiyonel hücre içi patojen yanıtının (IPR) düzenlenmesi 17, 18.
C. elegans enfeksiyonu için protokoller mevcut çalışmada tanımlanmıştır ve benzersiz mikrosporidia biyolojisini ortaya çıkarmak ve konağın enfeksiyona tepkisini incelemek için kullanılabilir. Kitin bağlayıcı boya Direct Yellow 96 (DY96) ile boyanmış sabit solucanların mikroskopisi, kitin içeren mikrosporidia sporlarının bağırsak boyunca enfeksiyon yayılımını gösterir. DY96 boyama ayrıca, konakçı uygunluğunun bir okuması olarak solucan yerçekiminin (embriyo üretme yeteneği) eşzamanlı olarak değerlendirilmesi için kitin içeren solucan embriyolarının görselleştirilmesini sağlar.
Son zamanlarda yapılan çalışmalar, N. parisii ile enfekte olmuş C. elegans’ın aynı enfeksiyona karşı sağlam bir şekilde dirençli yavrular ürettiğini ortaya koymuştur19. Bu kalıtsal bağışıklık tek bir nesil sürer ve doza bağımlıdır, çünkü daha ağır enfekte olmuş ebeveynlerden gelen yavrular mikrosporidiaya karşı daha dirençlidir. İlginçtir ki, N. parisii astarlı yavrular, doğal patojen Orsay virüsü19’a karşı korunmamalarına rağmen, bakteriyel bağırsak patojeni Pseudomonas aeruginosa’ya karşı daha dirençlidir. Bu çalışma ayrıca immün astarlanmış yavruların mikrosporidia tarafından konakçı hücre invazyonunu sınırladığını göstermektedir. Yöntem ayrıca bağışıklık astarlanmış yavruların toplanmasını ve FISH’in bağırsak hücrelerinde konakçı hücre invazyonu ve spor ateşlemesi20’yi test etmek için N. parisii RNA’yı tespit etmek için nasıl kullanılabileceğini açıklar.
Birlikte, bu protokoller C. elegans’ta mikrosporidia ve kalıtsal bağışıklığı incelemek için sağlam bir temel sağlar. Bu model sistemindeki gelecekteki çalışmaların, kalıtsal bağışıklığın yeni ortaya çıkan alanında önemli keşiflere olanak sağlayacağı umulmaktadır. Bu tekniklerin aynı zamanda diğer konakçı organizmalarda mikrosporidia kaynaklı kalıtsal bağışıklığı araştırmak için başlangıç noktaları olması muhtemeldir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokol, mikrosporidia ve kalıtsal bağışıklığın basit ve genetik olarak izlenebilir bir N. parisii –C. elegans enfeksiyon modelinde incelenmesini açıklamaktadır.
Spor hazırlama, üretkenliğe bağlı olarak tipik olarak 6 aylık deneyler için yeterli spor veren yoğun bir protokoldür24. Önemli olarak, deneyler için kullanmadan önce her yeni spor “lotu” için bulaşıcılık belirlenmelidir. Spor preparatları arasındaki bulaşıc?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Winnie Zhao ve Yin Chen Wan’a el yazması hakkında yararlı yorumlar yaptıkları için minnettarız. Bu çalışma Kanada Doğa Bilimleri ve Mühendislik Araştırma Konseyi (Hibe #522691522691) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| 2.0 mm zirconia beads | Biospec Products Inc. | 11079124ZX | |
| 10 mL syringe | Fisher Scientific | 1482613 | |
| 5 μm filter | Millipore Sigma | SLSV025LS | |
| Axio Imager 2 | Zeiss | – | Fluorescent microscope for imaging of DY96- and FISH- stained worms on microscope slides |
| Axio Zoom V.16 Fluorescence Stereo Zoom Microscope | Zeiss | – | For live imaging of fluorescent transgenic animals to visualize the IPR |
| Baked EdgeGARD Horizontal Flow Clean Bench | Baker | – | |
| Bead disruptor, Genie SI-D238 Analog Disruptor Genie Cell Disruptor, 120 V | Global Industrial | T9FB893150 | |
| Cell-VU slide, Millennium Sciences Disposable Sperm Count Cytometers | Fisher Scientific | DRM600 | |
| Direct Yellow 96 | Sigma-Aldrich | S472409-1G | |
| EverBrite Mounting Medium with DAPI | Biotium | 23001 | |
| EverBrite Mounting Medium without DAPI | Biotium | 23002 | |
| Fiji/ImageJ software | ImageJ | https://imagej.net/software/fiji/downloads | |
| Mechanical rotor | Thermo Sceintific | 415110 / 1834090806873 | Used to spin tubes of bleached embryos for overnight hatching |
| MicroB FISH probe | Biosearch Technologies Inc. | – | Synthesized with a Quasar 570 (Cy3) 5' modification and HPLC purified, CTCTCGGCACTCCTTCCTG |
| N2 | Wild-type, Bristol strain | Default strain | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | L3771-100G | |
| Sodium hydroxide solution (5 N) | Fisher Chemical | FLSS256500 | |
| Sodium hypochlorite solution (6%) | Fisher Chemical | SS290-1 | |
| Stemi 508 Stereo Microscope | Zeiss | – | For daily maintenance of worms and counting of L1 worms for assay set ups |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P1379-100ML | |
| Vectashield + A16 | Biolynx | VECTH1500 |
Riferimenti
- Tetreau, G., Dhinaut, J., Gourbal, B., Moret, Y. Trans-generational immune priming in invertebrates: current knowledge and future prospects. Frontiers in Immunology. 10, 1938 (2019).
- Au, V., et al. CRISPR/Cas9 methodology for the generation of knockout deletions in Caenorhabditis elegans. G3 Genes|Genomes|Genetics. 9 (1), 135-144 (2019).
- Kamath, R. Genome-wide RNAi screening in Caenorhabditis elegans. Methods. 30 (4), 313-321 (2003).
- The C. elegans Sequencing Consortium. Genome sequence of the nematode C. elegans: a platform for investigating biology. Science. 282 (5396), 2012-2018 (1998).
- Yoshimura, J., et al. Recompleting the Caenorhabditis elegans genome. Genome Research. 29, 1009-1022 (2019).
- Weinhouse, C., Truong, L., Meyer, J. N., Allard, P. Caenorhabditis elegans as an emerging model system in environmental epigenetics: C. elegans as an environmental epigenetics model. Environmental and Molecular Mutagenesis. 59 (7), 560-575 (2018).
- Ermolaeva, M. A., Schumacher, B. Insights from the worm: the C. elegans model for innate immunity. Seminars in Immunology. 26 (4), 303-309 (2014).
- Willis, A. R., Sukhdeo, R., Reinke, A. W. Remembering your enemies: mechanisms of within-generation and multigenerational immune priming in Caenorhabditis elegans. TheFEBS Journal. 288 (6), 1759-1770 (2020).
- Burton, N. O., et al. Cysteine synthases CYSL-1 and CYSL-2 mediate C. elegans heritable adaptation to P. vranovensis infection. Nature Communications. 11, 1741 (2020).
- Wadi, L., Reinke, A. W. Evolution of microsporidia: an extremely successful group of eukaryotic intracellular parasites. PLoS Pathogens. 16, 1008276 (2020).
- Han, B., Takvorian, P. M., Weiss, L. M. Invasion of host cells by microsporidia. Frontiers in Microbiology. 11, 172 (2020).
- Tamim El Jarkass, H., Reinke, A. W. The ins and outs of host-microsporidia interactions during invasion, proliferation and exit. Cellular Microbiology. 22 (11), 13247 (2020).
- Balla, K. M., Lažetić, V., Troemel, E. R. Natural variation in the roles of C. elegans autophagy components during microsporidia infection. PLoS ONE. 14, 0216011 (2019).
- Szumowski, S. C., Estes, K. A., Troemel, E. R. Preparing a discreet escape: Microsporidia reorganize host cytoskeleton prior to non-lytic exit from C. elegans intestinal cells. Worm. 1 (4), 207-211 (2012).
- Balla, K. M., Luallen, R. J., Bakowski, M. A., Troemel, E. R. Cell-to-cell spread of microsporidia causes Caenorhabditis elegans organs to form syncytia. Nature Microbiology. 1 (11), 1-6 (2016).
- Reinke, A. W., Balla, K. M., Bennett, E. J., Troemel, E. R. Identification of microsporidia host-exposed proteins reveals a repertoire of rapidly evolving proteins. Nature Communications. 8, 14023 (2017).
- Bakowski, M. A., et al. Ubiquitin-mediated response to microsporidia and virus infection in C. elegans. PLoS Pathogen. 10, 1004200 (2014).
- Reddy, K. C., et al. An intracellular pathogen response pathway promotes proteostasis in C. elegans. Current Biology. 27 (22), 3544-3553 (2017).
- Willis, A. R., et al. A parental transcriptional response to microsporidia infection induces inherited immunity in offspring. Science Advances. 7 (19), (2021).
- Tamim El Jarkass, H., et al. An intestinally secreted host factor promotes microsporidia invasion of C. elegans. eLife. 11, 72458 (2022).
- Solis, G. M., Petrascheck, M. Measuring Caenorhabditis elegans life span in 96 well microtiter plates. Journal of Visualized Experiments. 49, 2496 (2011).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , (2006).
- Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. Measuring Caenorhabditis elegans life span on solid media. Journal of Visualized Experiments. (27), e1152 (2009).
- Estes, K. A., Szumowski, S. C., Troemel, E. R. Non-lytic, actin-based exit of intracellular parasites from C. elegans intestinal cells. PLOS Pathogens. 7, 1002227 (2011).
- Botts, M. R., Cohen, L. B., Probert, C. S., Wu, F., Troemel, E. R. Microsporidia intracellular development relies on myc interaction network transcription factors in the host. G3 Genes|Genomes|Genetics. 6 (9), 2707-2716 (2016).
- Corsi, A. K. A Transparent window into biology: A primer on Caenorhabditis elegans. WormBook. , 1-31 (2015).
- Rivera, D. E., Lažetić, V., Troemel, E. R., Luallen, R. J. RNA fluorescence in situ hybridization (FISH) to visualize microbial colonization and infection in the Caenorhabditis elegans intestines. bioRxiv. , (2022).
- Zhang, G., et al. A large collection of novel nematode-infecting microsporidia and their diverse interactions with Caenorhabditis elegans and other related nematodes. PLoS Pathogens. 12, 1006093 (2016).
- Luallen, R. J., et al. Discovery of a natural microsporidian pathogen with a broad tissue tropism in Caenorhabditis elegans. PLoS Pathogens. 12, 1005724 (2016).
- Troemel, E. R., Félix, M. -. A., Whiteman, N. K., Barrière, A., Ausubel, F. M. Microsporidia are natural intracellular parasites of the nematode Caenorhabditis elegans. PLoS Biology. 6, 309 (2008).
- Burton, N. O., et al. Intergenerational adaptations to stress are evolutionarily conserved, stress-specific, and have deleterious trade-offs. eLife. 10, 73425 (2021).
- Jaroenlak, P., et al. 3-Dimensional organization and dynamics of the microsporidian polar tube invasion machinery. PLoS Pathogens. 16, 1008738 (2020).
- Weidner, E., Manale, S. B., Halonen, S. K., Lynn, J. W. Protein-membrane interaction is essential to normal assembly of the microsporidian spore invasion tube. The Biological Bulletin. 188 (2), 128-135 (1995).
