Summary
本文介绍了光谱聚焦模块和双输出脉冲激光器的集成，可实现金纳米颗粒和癌细胞的快速高光谱成像。这项工作旨在证明标准激光扫描显微镜上多模态非线性光学技术的细节。
Abstract
探测生命系统中的金纳米颗粒（AuNPs）对于揭示AuNPs与生物组织之间的相互作用至关重要。此外，通过将受激拉曼散射（SRS）、双光子激发荧光（TPEF）和瞬态吸收（TA）等非线性光信号集成到成像平台中，可用于以多模态方式揭示细胞结构和AuNPs的生物分子对比度。本文介绍了一种多模态非线性光学显微镜，并将其应用于癌细胞中AuNPs的化学特异性成像。该成像平台提供了一种新方法，用于开发更有效的功能化AuNPs并确定它们是否位于肿瘤，细胞周围或细胞空间周围的脉管系统中。
Introduction
金纳米颗粒（AuNPs）作为生物相容性成像探针显示出巨大的潜力，例如，作为各种生物医学应用中的有效表面增强拉曼光谱（SERS）基底。主要应用包括生物传感、生物成像、表面增强光谱和用于癌症治疗的光热疗法等领域1。此外，探测生命系统中的AuNPs对于评估和理解AuNPs与生物系统之间的相互作用至关重要。有多种分析技术，包括傅里叶变换红外（FTIR）光谱2，激光烧蚀电感耦合质谱（LA-ICP-MS）3和磁共振成像（MRI）4 ，已成功用于研究组织中AuNPs的分布。然而，这些方法存在一些缺点，例如耗时且涉及复杂的样品制备3，需要较长的采集时间或缺乏亚微米空间分辨率2，4。
与传统成像技术相比，非线性光学显微镜在探测活细胞和AuNP方面具有几个优势：非线性光学显微镜实现了更深的成像深度，并通过使用近红外超快激光器提供了固有的3D光学切片能力。随着成像速度和检测灵敏度的显著提高，双光子激发荧光（TPEF）5，6，7和二次谐波发生（SHG）8，9，10显微镜已被证明可以进一步改善活细胞和组织中内源性生物分子的无创成像。此外，利用新型泵浦探针非线性光学技术，如瞬态吸收（TA）11，12，13，14和受激拉曼散射（SRS）15，16，17，18，可以得出细胞结构和AuNPs的无标记生化对比。不使用外在标记可视化AuNPs非常重要，因为纳米颗粒的化学扰动会改变它们的物理性质，从而改变它们在细胞中的吸收。
该协议介绍了用于双波长脉冲激光器的光谱聚焦定时和复合单元（SF-TRU）模块的实施，可实现AuNP和癌细胞的快速多模态成像。这项工作旨在展示激光扫描显微镜上集成TPEF，TA和SRS技术的细节。
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Protocol
1. 打开激光系统
- 在启动系统之前，打开联锁系统并选择臂激光器。
- 使用软件打开PC以控制双输出飞秒激光器。
- 加载双输出飞秒激光器的软件;该软件使激光器能够打开和关闭电源，并直接控制泵浦光束的波长。
- 通过按住电源图标计数 3 来打开激光发射。
- 等到激光预热并在软件中将激光就绪灯亮起绿色。
- 泵浦光束的波长通过软件直接控制;范围为 680-1，300 nm。对于 C-H 拉曼振动区域的细胞成像，请选择 802 nm。
- 按住光圈图像3秒，打开可调泵浦光束和1，045 nm斯托克斯光束的快门。
注意：激光安全引导 双输出飞秒激光器是IV类红外脉冲激光器，可能对视力造成永久性损害。因此，在执行此程序时必须遵守所有激光安全当地规则：（i）只有接受过激光安全培训的授权用户才能执行该程序。（ii） 通过刷卡进入实验室，房间门上有联锁装置。（iii） 对于大多数操作，激光束是完全封闭的。（iv） 当激光束暴露时，必须佩戴激光安全护目镜（使用 LG9 激光安全护目镜，它可以阻挡泵浦和斯托克斯光束的 OD 7+）。
2. 打开光谱聚焦定时和复合单元 （SF-TRU）
- 使用激光软件在同一台PC上加载ATM软件，该软件控制SF-TRU单元中的延迟级和激光衰减器。
注意：该装置负责确保泵和斯托克斯梁在空间上重叠，控制泵和斯托克斯梁中的色散，以及控制泵和斯托克斯梁之间的时间延迟。泵浦和斯托克斯光束的极化都是垂直的。请注意，每个光束都配备了一个半波板，以便在离开SF-TRU之前独立控制偏振。 - 确保泵浦和斯托克斯激光器都衰减到<10%（泵浦）和<15%（斯托克斯光束）。如果光束没有衰减，激光功率会对系统造成损坏，并会烧毁生物样品。
- 对于细胞成像，将最佳激光设置设置为 6%（泵浦）和 10%（斯托克斯），对应于样品处的 12 mW 和 30 mW。
- SF-TRU 有两种设置：飞秒 （fs） 模式和皮秒 （ps） 模式。
- 对于 fs 模式，推入盒子两侧的旋钮（这会从光束路径中移除色散光栅）。
- 对于 ps 模式，拉出盒子两侧的旋钮（这会将色散光栅放置在光束路径中）。
- 对于高光谱成像，请选择 ps 模式。
- 确保延迟级处于正确的位置，以便泵浦和斯托克斯光束在此系统上进行C-H成像的时间重叠。
- 确保泵和斯托克斯梁的分散设置正确;对于 802 nm 泵浦，泵浦光束为 5 mm，斯托克斯光束为 30 mm。
3. 调制斯托克斯光束以进行SRS成像
- 对于SRS检测，调制斯托克斯光束的强度。
- 打开信号发生器以进行波束调制。
- 回想一下以前的设置，如下所示：
输出 1：方波：频率 = 19.5 MHz，幅度 = 1.4 V。
输出 2：方波：频率 = 19.5 MHz，幅度 = 300 mV。 - 打开输出 1 和 2。
- 通过 BNC 电缆 将 输出 1 连接到 SF-TRU 盒中用于 EOM 的放大器。
- 通过 BNC 电缆 将 输出 2 连接到用于 SRS 检测的锁相放大器。
- 打开龙门架上放大器的电源。
4. 接通锁相放大器
- 对于SRS成像，请使用SRS检测模块，该模块由大面积光电二极管和专用锁相放大器组成。
- 打开龙门架上锁相放大器的电源。
- 在PC上加载锁相放大器“SRS检测模块”的软件。
- 在软件中，选择以下设置：相位 = 0°，偏移 = -80 mW，增益 = 58 dB。
- 在软件中选择锁相放大器积分时间常数：对于细胞成像，2 μs的时间常数可提供高质量的图像。
5. 在激光扫描显微镜上操作
- 打开除遥控箱以外的所有设备的插头。等待位于龙门架顶部的控制盒上的待机点亮。
- 打开龙门架上的遥控盒，然后打开盒子背面。等到遥控器指示灯变为蓝色（在控制盒上），然后按 开始操作。
- 打开激光扫描显微镜的PC。
- 运行共聚焦显微镜软件。
- 通过计算机软件 检查 显微镜的光路。
注意：对显微镜进行了一些修改，使其适用于SRS成像：（i）在光束路径中，在激光束进入扫描单元的滤光轮上增加了775 nm短通，可以在计算机软件的光路选项卡中选择。（ii）代替使用共聚焦显微镜的内置PMT进行检测，而是在透射光路中添加了定制的检测器，可以同时进行SRS和CARS检测。（iii） 这些探测器的输出连接到龙门架上的模拟盒。来自PMT的CARS信号通过BNC电缆连接到CD1，来自锁相放大器的SRS信号通过BNC电缆连接到CD2。 - 通过触摸屏或遥控旋钮或计算机软件控制对焦。
- 在软件中选择所需的图像设置;这包括缩放、以像素为单位的图像大小和像素停留时间。
- 确保成像速度（像素停留时间）大于锁相放大器软件中设置的积分时间。
注：使用NA 1.2水浸物镜进行成像。
6. 在显微镜载物台上安装样品
- 准备细胞样品进行成像，如下所示。
- 在补充有10%胎牛血清（FBS）的RPMI-1640中培养4T1小鼠乳腺癌细胞。每2天更换一次培养基，并以70%-80%汇合度传代细胞。
注意：段落8-10在整个实验过程中使用。 - 对于成像实验，在37°C，5%CO2下在方形盖玻片上孵育1 x 105细胞24小时。然后，用预热的磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤细胞，并与金纳米颗粒（在细胞培养基中1：100稀释，储备浓度：2.3 x 1010颗粒/ mL，直径：60nm）孵育4小时。
- 在成像之前，用冰冷的PBS洗涤细胞，并在室温（RT）下用PBS中的4%多聚甲醛固定15分钟。用PBS 3x洗涤细胞，然后安装在两个盖玻片之间进行成像。
- 在补充有10%胎牛血清（FBS）的RPMI-1640中培养4T1小鼠乳腺癌细胞。每2天更换一次培养基，并以70%-80%汇合度传代细胞。
- 将一滴蒸馏水放在水浸物镜的顶部，将激光束聚焦到物镜和样品之间的样品上。然后，将样品放在显微镜载物台上。
- NA 1.4的聚光镜收集向前传播的光。在冷凝器和样品之间施加一滴水进行成像。将聚光镜的高度调整到样品上方约 1 毫米，以收集最大光量。
- SRS检测器位于可移动支架上，允许其从采集光路中滑入和滑出。为了使用白光聚焦在样品上，请将SRS检测器移出光束路径。
- 将探测器放回光束路径中，准备进行SRS成像。
7. 改变拉曼位移并收集高光谱数据堆栈
注意：成像发生的拉曼位移取决于SF-TRU盒中的延迟级位置和激光系统的泵浦光束波长。
- 对于拉曼位移的较大变化，请更改激光波长。例如，对于2，800–3，100 cm-1之间的CH振动成像，请选择802 nm，而对于酰胺I峰约1，600 cm-1的成像，请选择898 nm处的泵浦光束。通过软件进行调整。
- 要对拉曼位移进行小幅调整，请扫描SF-TRU单元中的延迟级。
- SF-TRU 以毫米 （mm） 为单位提供延迟级位置。要将延迟级位置从mm转换为cm-1，请使用聚苯乙烯微球样品执行校准高光谱扫描，并将校准扫描中发现的峰位置与自发拉曼设置中检测到的峰位置进行比较。这将提供一个线性方程，该方程将以mm为单位的延迟级位置转换为以cm-1为单位的拉曼位移。
- 要生成高光谱扫描，请在不同的延迟阶段位置拍摄图像的时间序列。
- 为了同步图像采集和延迟级的移动，请使用模拟单元在SF-TRU系统之间发送和接收TTL信号。
注意：为此，模拟盒具有以下连接：（i） TRIG OUT VD1 — 通过 BNC 连接到 SF-TRU 并发送 TTL 信号以告知延迟级移动 +1 增量。（ii） TRIG 在1中—此处，当延迟级完成其运动时，通过BNC 接收 信号，该信号用于触发时间序列中的下一个图像。 - 对于高光谱数据集，请在共聚焦显微镜软件中选择以下设置：
- 在 “触发器 ”选项卡中，选择“ 通过 TTL 触发器启动 （开）”和 “触发器 （每帧）”。
- 在“序列”选项卡中，将时间 序列 设置为 ON ，将 z 序列设置为 OFF。
- 设置时间序列中的帧数以匹配 ATM 软件中的步数（此处使用 101 步）。
- 在 ATM 软件中，转到 “运行 ”选项卡。
- 设置高光谱扫描开始和停止的延迟阶段位置（以毫米为单位）。对于 CH 高波数区域，使用起始位置 = 90.25 mm，停止位置 = 92.25 mm。
- 确保步数与共聚焦显微镜软件中的帧数相匹配。
- 检查正确的设置后，首先在共聚焦显微镜软件中启动高光谱堆栈。转到 获取 并单击 开始扫描。然后，在ATM软件中，单击 开始。这将启动一系列图像的收集，所选开始和停止位置之间的延迟级位置逐渐增加
- 将高光谱图像系列导出为多帧.tif文件，并使用合适的软件包进行校准。
- 校准完成后，使用线性校准方程将延迟级位置转换为拉曼位移。
- 要在CH振动区域（2，800–3，100 cm-1）和酰胺I振动区域1，500–1，700 cm-1）的成像之间切换，请执行以下操作。
- 将激光软件中的泵浦波长从 802 nm 更改为 898 nm。
- 将 ATM 软件中的斯托克斯色散设置从 30 mm 更改为 5 mm。
- 对SF-TRU箱内泵浦束扩散通道中的镜子进行小幅调整。这是通过调整后视镜支架上的下旋钮来完成的，该旋钮会逐渐改变镜子角度。
- 在酰胺I区域执行高光谱扫描时，将ATM软件中的开始和停止位置分别设置为89和91mm
注意：此步骤必须佩戴激光安全护目镜，因为激光束将暴露在外。
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Representative Results
光谱聚焦定时和复合单元（SF-TRU）模块在双输出飞秒激光器和改进的激光扫描显微镜之间引入。本研究中使用的可调谐超快激光系统有两个输出端口，提供一束固定波长为1，045 nm的光束，另一束在680-1，300 nm的范围内可调谐。SF-TRU模块和多模态成像平台的详细原理图如图 1所示。SF-TRU 用于将两个飞秒激光束啁啾到皮秒脉冲，并在空间和时间上重叠两个光束。高光谱受激拉曼散射（SRS）成像是通过扫描皮秒泵和斯托克斯脉冲之间的延迟来进行的。
所有样品都由脉冲激光通过改进的倒置显微镜上的高数值孔径（NA）物镜照射。SRS和TPEF信号通过高数值孔径电容沿正向收集。对于SRS显微镜，可调谐（680-1，300 nm）和固定（1，045 nm）激光输出分别用作泵浦和斯托克斯光束。大面积光电二极管和锁相放大器的组合用于执行SRS成像，而斯托克斯光束则被两个滤光片（890/210带通和950 nm短通滤光片）阻挡。与基于皮秒激光的系统相比，光谱聚焦SRS方法的一个重要优势是能够通过简单地控制啁啾泵和斯托克斯脉冲之间的时间延迟来调整感兴趣的拉曼位移。这种方法允许在不改变泵浦和斯托克斯波长的情况下快速探测数百个波数范围内的拉曼位移，从而实现更快的高光谱成像。
为了验证光谱分辨率和化学选择性的性能，首先对聚苯乙烯（PS）微球样品进行成像（图2）。样品处的激光功率（60x NA 1.2水浸物镜后）对于1，045 nm斯托克斯光束为10 mW，对于802 nm泵浦光束为20 mW。可以在帧中的每个像素处提取SRS光谱。 图2B 显示了PS磁珠的高光谱SRS光谱。为了进行比较，PS磁珠的自发拉曼光谱如图 2A所示。PS微球的SRS和自发拉曼光谱几乎相同，除了两侧的相对强度差异。这些光谱测量允许将光学延迟块级（mm）转换为拉曼波数（cm-1）以进行SRS成像。
由于碳氢拉伸振动带中主要生物分子的拉曼光谱在2，800-3，050cm-1范围内，因此4T1癌细胞的SRS成像在2，852 cm−1（脂质），2，930 cm-1（蛋白质），2，968 cm-1（DNA）下进行，叠加图像如图3所示。以512 x 512像素的帧尺寸以4 μs的像素停留时间获取不同拉曼波段的SRS图像。
最后，该方法进一步扩展到用金纳米颗粒（AuNPs）给药的4T1癌细胞的多模态成像，使我们能够更精确地成像AuNPs在癌细胞中的分布。采集的SRS（CH2 和CH3 通道）、TPEF（LysoTracker荧光探针）和TA（非共振SRS通道）图像如图 4所示。
图1：高光谱多模态成像平台示意图。 多模态非线性光学显微镜图示。DM，二向色镜;DS，延迟阶段;EOM，电光调制器;FG，函数发生器;FL，过滤器;G，光栅;LIA，锁相放大器;M，镜子;OBJ，客观;PD，光电二极管;光电倍增管，光电倍增管;SF-TRU、光谱聚焦定时和复合单元。 请点击此处查看此图的大图。
图 2：聚苯乙烯 （PS） 微球的光谱。 PS微球的自发（A）拉曼光谱与（B）高光谱SRS光谱吻合较好。 请点击此处查看此图的大图。
图 3：4T1 癌细胞的光谱 SRS 成像。SRS 图像在 2，852 cm−1、2，930 cm−1、2，968 cm−1 和叠加图像。比例尺：10 μm。 请点击此处查看此图的大图。
图4：4T1癌细胞摄取金纳米颗粒的多模态成像。2，852 cm−1 （CH2）、2，928 cm−1 （CH3）、3，080 cm−1（非共振，仅剩 TA 信号）、TPEF 和叠加图像的高光谱 SRS 图像。比例尺：10 μm。 请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
本研究介绍了SF-TRU模块与超快双输出激光系统的组合，展示了其在多模态显微光谱中的应用。凭借其研究金纳米颗粒（AuNPs）被癌细胞吸收的能力，多模态成像平台可以可视化激光束被AuNPs吸收时细胞对热疗癌症治疗的反应。
此外，通过采用光谱聚焦技术，使用两组光栅对来控制每个激光束中的线性调频，可以实现快速化学特异性成像和高光谱分辨率。与使用固定长度的玻璃棒进行啁啾相比，光栅对允许匹配感兴趣的拉曼线的光谱分辨率和线宽19。
此外，该系统可以通过利用专门设计的手动滑块从光束路径中移除光栅，从而轻松地从飞秒切换到啁啾皮秒状态，而不会影响显微镜内的对准。为了实现高灵敏度和光谱分辨率，SRS通常使用窄带皮秒泵和斯托克斯脉冲来实现。然而，皮秒激光器不足以满足需要更高峰值功率水平的多光子激发，而飞秒激光器可以实现。多模态功能允许将该方法用于各种应用，例如多光子成像20，相干拉曼散射21和泵浦探针光谱。
有几种策略可用于进一步提高所演示设备的性能。例如，更快的电动延迟块级和数据采集软件提供更高的成像速率，从而提高多模态成像平台的吞吐量。此外，目前的设置覆盖了~300 cm−1的光谱范围，光谱分辨率高达5 cm−1。为了进一步扩大光谱范围，高光谱SRS显微镜采用了具有更宽光谱带宽的改进激光系统22。
总的来说，这种多模态和非侵入性成像平台为纳米医学提供了新的见解，并为细胞、生物组织和纳米颗粒的高内涵多模态分子成像开辟了一条新途径23，24，25。
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Disclosures
作者声明不存在利益冲突。
Acknowledgments
这项研究得到了EPSRC资助：拉曼纳米诊断学（EP / R020965 / 1）和对比设施（EP / S009957 / 1）的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| APE SRS Detection Unit | APE (Angewandte Physik & Elektronik GmbH) | APE Lock-in Module | Combined system containing a large area Si photo-diode for detecting the pump beam along with a Lock-In amplifier for detecting the beam modulations |
| Confocal Scanning Unit | Olympus | FV 3000 | Confocal scanning unit used for imaging |
| CML Latex Beads, 4% w/v, 1.0 µm | Invitrogen | C37483 | Polystyrene microspheres |
| Coverslips | Thorlabs | CG15CH2 | 22 mm x 22 mm coverslips for seeding cells |
| FBS | Gibco | 10500-064 | Foetal Bovine Serum (Heat Inactivated) |
| Flouview | Olympus | FV31S-SW | Laser scanning microscope control software |
| Function Generator | BX precision | 40543 | Used to generate square wave function which is fed to EOM in SF-TRU to produce modulations in the stokes beam |
| Gold Nanoparticles | Nanopartz | A11-60 | Spherical gold nanoparticles, 60 nm diameter |
| Input Output Interface | Olympus | FV30 ANALOG | This unit allows voltage readouts from PMT and LockIn to be fed into the confocal scanning software and allows timing pulses to be sent between the olympus microscope and the SF-TRU unit. |
| InSight X3 | Newport | Spectra-Physics | Dual-output femtosecond pulsed laser. Tunable (680–1300 nm) and fixed (1045 nm) laser outputs with the repetition rate of 80 MHz. |
| Microscope Frame | Olympus | IX83 | Inverted microscope |
| Mouse 4T1 cells | ATCC | CRL-2539 | Mouse breast cancer cells |
| NA 1.2 Water Immersion Objective | Olympus | UPLSAPO60XW/IR | The multiphoton 60x Objective has a 0.28 mm working distance. Other similar objectives can be used. |
| NA 1.4 Condenser | Nikon | CSC1003 | Other condensers with NA higher than the excitation objective can also be used. |
| PMT | Hamamatsu | R3896 | PMT used for detecting anti-stokes photos for CARS micrsocopy |
| PMT Connector | Hamamatsu | C13654-01-Y002 | Connector for PMT |
| Power Supply | RS | RSPD-3303 C | Programmable power supply which is used for providing the correct voltage to the PMT |
| RPMI-1640 | Gibco | A10491-01 | Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium has since been found suitable for a variety of mammalian cells. |
| SF-TRU | Newport Spectra Physics | SF-TRU | System designed for controlling the time delay and dispersion of the 2 laser outputs and for performing the beam modulations required for SRS |
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