Imágenes biomoleculares de la captación celular de nanopartículas mediante microscopía óptica multimodal no lineal
Summary
Este artículo presenta la integración de un módulo de enfoque espectral y un láser de pulso de doble salida, lo que permite obtener imágenes hiperespectrales rápidas de nanopartículas de oro y células cancerosas. Este trabajo tiene como objetivo demostrar los detalles de las técnicas ópticas no lineales multimodales en un microscopio de escaneo láser estándar.
Abstract
El sondeo de nanopartículas de oro (AuNP) en sistemas vivos es esencial para revelar la interacción entre AuNP y tejidos biológicos. Además, al integrar señales ópticas no lineales como la dispersión Raman estimulada (SRS), la fluorescencia excitada de dos fotones (TPEF) y la absorción transitoria (TA) en una plataforma de imágenes, se puede utilizar para revelar el contraste biomolecular de las estructuras celulares y AuNP de manera multimodal. Este artículo presenta una microscopía óptica no lineal multimodal y la aplica para realizar imágenes químicamente específicas de AuNPs en células cancerosas. Esta plataforma de imágenes proporciona un enfoque novedoso para desarrollar AuNP funcionalizadas más eficientes y determinar si están dentro de las vasculaturas que rodean el tumor, los espacios pericelulares o celulares.
Introduction
Las nanopartículas de oro (AuNP) han demostrado un gran potencial como sondas de imágenes biocompatibles, por ejemplo, como sustratos efectivos de espectroscopía Raman mejorada en superficie (SERS) en diversas aplicaciones biomédicas. Las principales aplicaciones incluyen campos como la biodetección, la bioimagen, las espectroscopias mejoradas por superficie y la terapia fototérmica para el tratamiento del cáncer1. Además, el sondeo de AuNP en sistemas vivos es crucial para evaluar y comprender la interacción entre AuNP y los sistemas biológicos. Existen varias técnicas analíticas, incluida la espectroscopia infrarroja por transformada de Fourier (FTIR)2, la espectrometría de masas acoplada inductivamente por ablación láser (LA-ICP-MS)3 y la resonancia magnética (RM)4 que se han utilizado con éxito para investigar la distribución de AuNP en los tejidos. Sin embargo, estos métodos adolecen de varios inconvenientes, como el tiempo y la preparación compleja de muestras3, que requieren largos tiempos de adquisición, o la falta de resolución espacial submicrónica 2,4.
En comparación con las técnicas de imagen convencionales, la microscopía óptica no lineal ofrece varias ventajas para sondear células vivas y AuNP: La microscopía óptica no lineal logra una profundidad de imagen más profunda y proporciona una capacidad de seccionamiento óptico 3D intrínseca con el uso de láseres ultrarrápidos de infrarrojo cercano. Con la mejora significativa de la velocidad de imagen y la sensibilidad de detección, se ha demostrado que la fluorescencia excitada de dos fotones (TPEF)5,6,7 y la microscopía de segunda generación armónica (SHG)8,9,10 mejoran aún más las imágenes no invasivas de biomoléculas endógenas en células y tejidos vivos. Además, utilizando nuevas técnicas ópticas no lineales bomba-sonda como la absorción transitoria (TA)11,12,13,14 y la dispersión Raman estimulada (SRS)15,16,17,18, es posible derivar un contraste bioquímico sin etiquetas de estructuras celulares y AuNPs. La visualización de AuNPs sin el uso de etiquetas extrínsecas es de gran importancia ya que las perturbaciones químicas de las nanopartículas modificarán sus propiedades físicas y, por lo tanto, su absorción en las células.
Este protocolo presenta la implementación de un módulo de Unidad de Recombinación y Sincronización de Enfoque Espectral (SF-TRU) para un láser de pulso de doble longitud de onda, lo que permite obtener imágenes multimodales rápidas de AuNP y células cancerosas. Este trabajo tiene como objetivo demostrar los detalles de las técnicas integradas de TPEF, TA y SRS en un microscopio de escaneo láser.
Protocol
Representative Results
Discussion
En este estudio se ha presentado la combinación del módulo SF-TRU y el sistema láser ultrarrápido de doble salida que demuestra sus aplicaciones para la microespectroscopia multimodal. Con su capacidad para investigar la absorción de nanopartículas de oro (AuNP) por las células cancerosas, la plataforma de imágenes multimodales puede visualizar las respuestas celulares a los tratamientos hipertérmicos contra el cáncer cuando los rayos láser son absorbidos por AuNP.
Además, se logra…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta investigación fue apoyada por EPSRC Grants: Raman Nanotheranostics (EP/R020965/1) y CONTRAST facility (EP/S009957/1).
Materials
| APE SRS Detection Unit | APE (Angewandte Physik & Elektronik GmbH) | APE Lock-in Module | Combined system containing a large area Si photo-diode for detecting the pump beam along with a Lock-In amplifier for detecting the beam modulations |
| Confocal Scanning Unit | Olympus | FV 3000 | Confocal scanning unit used for imaging |
| CML Latex Beads, 4% w/v, 1.0 µm | Invitrogen | C37483 | Polystyrene microspheres |
| Coverslips | Thorlabs | CG15CH2 | 22 mm x 22 mm coverslips for seeding cells |
| FBS | Gibco | 10500-064 | Foetal Bovine Serum (Heat Inactivated) |
| Flouview | Olympus | FV31S-SW | Laser scanning microscope control software |
| Function Generator | BX precision | 40543 | Used to generate square wave function which is fed to EOM in SF-TRU to produce modulations in the stokes beam |
| FV3000 | Olympus | IX83P2ZF | Other microscope frames can be used. |
| Gold Nanoparticles | Nanopartz | A11-60 | Spherical gold nanoparticles, 60 nm diameter |
| Input Output Interface | Olympus | FV30 ANALOG | This unit allows voltage readouts from PMT and LockIn to be fed into the confocal scanning software and allows timing pulses to be sent between the olympus microscope and the SF-TRU unit. |
| InSight X3 | Newport | Spectra-Physics | Dual-output femtosecond pulsed laser. Tunable (680–1300 nm) and fixed (1045 nm) laser outputs with the repetition rate of 80 MHz. |
| Microscope Frame | Olympus | IX83 | Inverted microscope |
| Mouse 4T1 cells | ATCC | CRL-2539 | Mouse breast cancer cells |
| NA 1.2 Water Immersion Objective | Olympus | UPLSAPO60XW/IR | The multiphoton 60x Objective has a 0.28 mm working distance. Other similar objectives can be used. |
| NA 1.4 Condenser | Nikon | CSC1003 | Other condensers with NA higher than the excitation objective can also be used. |
| PMT | Hamamatsu | R3896 | PMT used for detecting anti-stokes photos for CARS micrsocopy |
| PMT Connector | Hamamatsu | C13654-01-Y002 | Connector for PMT |
| Power Supply | RS | RSPD-3303 C | Programmable power supply which is used for providing the correct voltage to the PMT |
| RPMI-1640 | Gibco | A10491-01 | Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium has since been found suitable for a variety of mammalian cells. |
| SF-TRU | Newport Spectra Physics | SF-TRU | System designed for controlling the time delay and dispersion of the 2 laser outputs and for performing the beam modulations required for SRS |
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