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Biologia

니트로환원효소/메트로니다졸 매개 절제 및 제브라피쉬 망막 색소 상피의 재생 연구를 위한 MATLAB 플랫폼(RpEGEN)

Published: March 02, 2022
doi:
10.3791/63658
, ,
1Department of Ophthalmology, Louis J. Fox Center for Vision Restoration,University of Pittsburgh School of Medicine, 2Earth Research Institute,University of California, Santa Barbara, 3Department of Developmental Biology,University of Pittsburgh School of Medicine

Summary

이 프로토콜은 형질전환 제브라피쉬 모델을 사용하여 망막 색소 상피(RPE)를 유전적으로 제거하는 방법론을 기술한다. 약리학적 화합물을 이용한 신호전달 경로 조절을 통합하도록 프로토콜을 적응시키는 것은 광범위하게 상세하다. 색소침착을 기반으로 RPE 재생을 정량화하기 위한 MATLAB 플랫폼이 개발되어 발표되고 논의됩니다.

Abstract

망막 색소 상피 (RPE)는 눈 뒤쪽에 상주하며 인접한 망막 및 혈관 조직의 건강과 무결성을 유지하는 데 필수적인 기능을 수행합니다. 현재, 작은 부상으로 제한되는 포유류 RPE의 제한된 회복 능력은 생체 내 RPE 재생 과정을 이해하는 데 진전을 방해했습니다. 여기에서, 강력한 조직 재생이 가능한 척추동물 모델인 제브라피쉬를 활용한 생체내 RPE 복구의 연구를 용이하게 하기 위한 상세한 방법론이 제공된다. 이 프로토콜은 트랜스제닉 니트로환원효소/메트로니다졸(NTR/MTZ) 매개 손상 패러다임(rpe65a:nfsB-eGFP)을 기술하며, 이는 MTZ로 24시간 치료 후 RPE의 중앙 2분의 2를 절제하고 후속 조직 회복을 초래합니다. 유충 제브라 피쉬의 RPE 절제술에 중점을두고 RPE 재생에 대한 약리학 적 화합물의 효과를 테스트하는 방법도 요약되어 있습니다. 색소침착을 기반으로 RPE 재생의 정량화를 자동화하기 위해 만들어진 MATLAB 스크립트인 RpEGEN의 생성 및 검증도 논의됩니다. 활성 RPE 복구 메카니즘을 넘어, 이 프로토콜은 RPE 변성 및 손상 반응에 대한 연구뿐만 아니라 다른 세포 및 분자 과정 중에서도 인접한 망막 및 혈관 조직에 대한 RPE 손상의 영향으로 확장될 수 있다. 이 제브라피쉬 시스템은 RPE 재생 및 RPE 질병 관련 메커니즘을 유도하는 유전자, 네트워크 및 프로세스를 식별하는 데 중요한 약속을 가지고 있으며,이 지식을 포유류 시스템에 적용하고 궁극적으로 치료 개발에 적용하는 장기적인 목표를 가지고 있습니다.

Introduction

본원에 기재된 방법론은 유충 제브라피쉬를 이용하는 망막 색소 상피(RPE)를 유전적으로 절제하기 위한 프로토콜을 상세히 기술한다. RPE는 눈 뒤쪽으로 확장되어 신경 망막의 층층과 맥락막을 구성하는 혈관 구조 층 사이에 있습니다. 영양 지원, 광독성 광의 흡수 및 시각 주기 단백질의 유지는 RPE가 수행하는 중요한 기능 중 일부에 불과하며, 이는 이러한 인접한 조직의 건강 및 완전성을 유지하는 데 필수적인1. 포유동물 RPE에 대한 손상은 병변이 작을 때 회복가능하다2; 그러나 더 큰 부상이나 진행성 퇴행성 질환으로 인한 손상은 돌이킬 수 없습니다. 인간에서 RPE 퇴행성 질환 (예를 들어, 연령 관련 황반 변성 (AMD) 및 Stargardt 질환)은 영구적 인 시력 상실을 초래하고 사용 가능한 치료 옵션이 거의 없기 때문에 환자의 삶의 질을 떨어 뜨립니다. 포유류 RPE가 자체 복구 할 수있는 제한된 능력은 RPE 재생 프로세스 분야에서 지식 격차를 창출했습니다. 다양한 조직 유형에 걸쳐 제브라피쉬의 강력한 재생 능력을 감안할 때,이 프로토콜은 본질적으로 재생 RPE에 대한 연구를 용이하게하고 그 반응을 유도하는 메커니즘을 밝히기 위해 생체 내 척추 동물 시스템을 구축하기 위해 개발되었습니다. 여기에 요약된 절제 패러다임을 사용하여, 정준 Wnt 신호전달 경로(3), mTOR 경로(4), 및 면역-관련 반응(5 )이 RPE 재생의 중요한 매개체로서 확인되었으며, 아마도 중첩된 기능을 갖는다.

이 유전자 절제 패러다임에서, Tg(rpe65a:nfsB-eGFP)3 제브라피쉬는 RPE 인핸서 요소인 rpe65a7의 제어하에 eGFP에 융합된 박테리아 유래 니트로리덕타제(NTR/nfsB) 유전자 6을 발현한다. 절제술은 전구 약물 인 메트로니다졸 (MTZ)을 시스템 수거용 제브라 피쉬에 첨가함으로써 달성됩니다. 니트로리덕타제에 의한 MTZ의 세포내 활성화는 NTR/nfsB 발현 세포 8,9에서 DNA 가교결합 및 아폽토시스를 초래한다. 이 기술은 망막10,11,12,13 및 기타 조직8의 세포를 제거하기 위해 제브라 피쉬에서 널리 사용되었습니다. 함께, 이들 요소들은 유도성 세포 절제 방법론(NTR/MTZ)8,9 및 시각화를 위한 형광 마커(eGFP)의 표적화된 발현(rpe65a)을 가능하게 한다.

RPE14의 재생 잠재력을 연구하는데 사용될 수 있는 다른 흥미로운 생체내 모델도 존재한다. 이들은 광범위하며 양서류에서 RPE-망막으로의 전분화 후 망막 절제술을 포함하며, 여기서 망막 재성장으로 손실된 RPE 세포는15,16으로 대체된다; RPE 회복 후 부상 후 “슈퍼 치유” MRL/MpJ 마우스17; 및 자발적 RPE 및 망막 변성의 래트 모델에서 RPE 증식의 외인성 자극및 18, 그 중에서도. 성체 인간 RPE 줄기 세포 (RPESCs)19와 같은 시험관내 모델도 또한 개발되었다. 이러한 모델은 RPE 재생과 관련된 세포 과정(예를 들어, 증식, 분화 등)을 밝히기 위해 작용하는 모든 유용한 도구이다; 그러나 제브라 피쉬는 절제 후 고유 한 RPE 수리 용량이 독특합니다.

여기의 방법론은 RPE 재생을 유도하는 메커니즘을 이해하는 데 초점을 맞추기 위해 작성되었지만 Tg (rpe65a : nfsB-eGFP) 라인과이 유전 적 절제 프로토콜은 RPE 아폽토시스, RPE 변성 및 인접한 망막 및 혈관 조직에 대한 RPE 손상의 효과와 같은 다른 세포 과정을 연구하는 데 활용 될 수 있습니다. 절제 프로토콜은 또한 약리학적 조작을 포함하도록 변형될 수 있으며, 이는 관심 있는 신호전달 경로를 스크리닝하기 위한 편리한 예비 전략이다. 예를 들어, Wnt Response-1 (IWR-1)20의 억제제를 사용하여 정준 Wnt 경로를 차단하면, RPE 재생3을 손상시키는 것으로 나타났다. 이것은 약리학 적 조작 실험을 통해 사용자를 안내하고 색소 침착의 회복을 기반으로 RPE 재생을 정량화하기 위해 생성 된 MATLAB 스크립트 (RpEGEN)를 검증하기위한 개념 증명 역할을하기 위해 여기에서 반복되었습니다. 트랜스제닉 라인 및 절제 프로토콜과 마찬가지로 RpEGEN 스크립트는 적응이 가능하며 RPE 내의 다른 마커/세포 프로세스를 정량화하는 데 사용할 수 있습니다.

Protocol

여기에 설명 된 모든 방법론은 피츠버그 대학의 IACUC (Institutional Animal Care and Use Committee)를 준수합니다. 1. 제브라피쉬 배아 채취 전의 제조 배아 배양기를 28.5°C로 설정합니다. 멜라닌 생성 억제제인 N-페닐티오우레아(PTU)21,22의 25x 원액을 제조하였다. 이 원액은 일반적인 레시피22?…

Representative Results

정준 Wnt 신호전달 경로를 억제하는 것은 프로토콜3에 기재된 유전자 절제 패러다임(rpe65a:nfsB-eGFP) 및 약리학적 조작 방법론(IWR-1)을 사용하여 제브라피쉬 RPE 재생을 유의하게 손상시키는 것으로 알려져 있다. 이 실험은 색소침착에 기초한 제브라피쉬 RPE 재생을 정량화하는 자동화된 방법을 검증하기 위해 여기에서 반복되었다. 아래에 요약 된 결과는 수정 일 (0dpf)부터 RpEGEN…

Discussion

이 프로토콜은 RPE를 유전적으로 완화시키는 방법론을 설명하고 유충 노화 제브라 피쉬에서 퇴행 및 재생 메커니즘을 연구합니다. 이 프로토콜은 또한 성인 제브라 피쉬3에서 성공적으로 수행되었지만 덜 광범위한 특성화로 인해 애벌레가 여기에 초점을 맞추고 있습니다. 프로토콜의이 부분의 중요한 측면 (단계 1-4)은 1) 멜라닌 생성의 발병 전에 배아에 1.5x PTU를 추가, 2) 2-3 dpf ?…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

본원에 기재된 작업은 국립 보건원 (RO1-EY29410 내지 J.M.G, 및 NIH CORE 그랜트 P30-EY08098 내지 안과)에 의해 지원되었다; UPMC 면역 이식 및 치료 센터 (L.L.L. 및 J.M.G.); 안과 연구의 E. Ronald Salvitti Chair (J.M.G.). 안과 Wiegand Fellowship in Ophthalmology (L.L.L), 피츠버그의 Eye & Ear Foundation, 그리고 실명 방지를위한 연구, 뉴욕, 뉴욕의 무제한 보조금으로부터 추가 지원이 접수되었습니다. 저자는 또한 기술 지원에 대한 아만다 플랫과 휴 해머 박사와 우수한 동물 관리 지원에 대한 수생 스태프에게 감사하고 싶습니다.

Materials

Lab Material/Equipment
2-(4-Amidinophenyl)-6-indolecarbamidine dihydrochloride (DAPI) Millipore Sigma D9542
6-well plates Fisher Scientific 07-200-83
Conical Polypropylene Centrifuge Tubes Fisher Scientific 05-539-13 Catalog number is for 50 mL tubes
Diamond tip scribing pen Fisher Scientific 50-254-51 Manufactured by Electron Microscopy Sciences, items similar to this part number are adequate
Dimethyl sulfoxide (DMSO) ≥99.7 % Fisher Scientific BP231 Check instiutional chemical waste disposal requirements
Embryo incubator (large) Fisher Scientific 3720A
Embryo incubator (mini/tabletop) Labnet I5110A
Fluorescence stereo microscope Zeiss Axio Zoom.V16 Or similar, with 488 nm excitation laser/filter
Glass Pasteur pipette Fisher Scientific 13-678-4 Manufactured by Corning, non-sterile
InSolution Wnt Antagonist I, IWR-1-endo Millipore Sigma 5.04462 Manufactured by Calbiochem; 25 mM in DMSO; check instiutional chemical waste disposal requirements
Methylene blue (powder) Fisher Scientific BP117-100 Also available as a premade aqeuous solution
Metronidazole (MTZ) Millipore Sigma M3761 Check instiutional chemical waste disposal requirements
N-phenylthiourea (PTU) Millipore Sigma P7629 Check instiutional chemical waste disposal requirements
Paraformaldehyde (16 % w/v) methanol free Fisher Scientific AA433689M Chemical waste, proper disposal required
Petri dishes Fisher Scientific FB0875712 10 cm diameter
Phosphate buffered saline (powder packets) Millipore Sigma P3813 Used to make 10 X PBS stock
Pronase Millipore Sigma PRON-RO
Shaking incubator Benchmark H2010 Used for incubating MTZ for 1 hour at 37 degrees Celcius
Stereo microscope Leica S9i Or similar, with transmitted light illumination
Student Dumont #5 forceps Fine Science Tools 91150-20 Fine-tipped forceps for manual dechorionation
Tabletop rotator/shaker Scilogex SK-D1807-E
Transfer pipette Millipore Sigma Z135003 3.2 mL bulb draw, non-sterile
Tricaine methanesulfonate (MS-222) Pentair TRS1, TRS2, TRS5 Also available from Fisher Scientific (NC0342409)
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI Vector Laboratories H-1200
Software Material
FIJI (Fiji is Just ImageJ) FIJI (Fiji is Just ImageJ) https://imagej.net/software/fiji/ Version: 2.0.0-rc-69/1.52p; Build: 269a0ad53f; Plugin needed: Bio-Formats
GRAMM examples and how-tos MathWorks https://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/54465-gramm-complete-data-visualization-toolbox-ggplot2-r-like.
MATLAB MathWorks https://www.mathworks.com/products/get-matlab.html Toolboxes needed to run RpEGEN: Image Processing Toolbox, Curve Fitting Toolbox, Statistics and Machine Learning Toolbox
MATLAB support MathWorks https://www.mathworks.com/support.html
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

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Leach, L. L., Fisher, G. B., Gross, J. M. Nitroreductase/Metronidazole-Mediated Ablation and a MATLAB Platform (RpEGEN) for Studying Regeneration of the Zebrafish Retinal Pigment Epithelium. J. Vis. Exp. (181), e63658, doi:10.3791/63658 (2022).
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