Fire metoder blev brugt til at detektere intracellulær Wolbachia, som supplerede hinanden og forbedrede detektionsnøjagtigheden af Wolbachia-infektion af Aedes albopictus-afledt Aa23 og Aa23-T helbredt af native Wolbachia-infektion ved hjælp af antibiotika.
Som en moderligt forankret endosymbiont inficerer Wolbachia store andele af insektpopulationer. Undersøgelser har for nylig rapporteret den vellykkede regulering af RNA-virusoverførsel ved hjælp af Wolbachia-transinficerede myg. Nøglestrategier til bekæmpelse af vira inkluderer manipulation af værtsgengivelse via cytoplasmisk inkompatibilitet og hæmning af virale transkripter via immunpriming og konkurrence om værtsafledte ressourcer. Imidlertid er de underliggende mekanismer for reaktionerne fra Wolbachia-transinficerede myg til virusinfektion dårligt forstået. Dette papir præsenterer en protokol til in vitro identifikation af Wolbachia-infektion ved nukleinsyre- og proteinniveauerne i Aedes albopictus (Diptera: Culicidae) Aa23-celler for at forbedre forståelsen af interaktionerne mellem Wolbachia og dets insektvektorer. Gennem kombineret anvendelse af polymerasekædereaktion (PCR), kvantitativ PCR, western blot og immunologiske analysemetoder er der beskrevet en standardmorfologisk protokol til påvisning af Wolbachia-inficerede celler, der er mere nøjagtig end brugen af en enkelt metode. Denne fremgangsmåde kan også anvendes til påvisning af Wolbachia-infektion i andre insekttaxa.
Den asiatiske tigermyg Aedes albopictus (Skuse) (Diptera: Culicidae), som er en nøglevektor for denguevirus (DENV) i Asien og andre dele af verden1, er en naturlig vært for to typer af de intracellulære bakterier, Wolbachia (wAlbA og wAlbB), som er fordelt over hele kimlinjen og somatisk væv 2,3. Aa23-cellelinjen afledt af A. albopictus-embryoner består af mindst to morfologiske celletyper, som begge understøtter infektion4 og kan helbredes for indfødt Wolbachia-infektion ved hjælp af antibiotika (Aa23-T). I betragtning af at Aa23 kun bevarer wAlbB, er det en nyttig model til undersøgelse af vært-endosymbiontinteraktioner 4,5,6.
Wolbachia overføres moderen og inficerer anslået 65% afinsektarterne 8,9 og 28% af myggene10. Det inficerer en række væv og danner et intimt symbiotisk forhold til værten, hvilket normalt inducerer cytoplasmisk inkompatibilitet (CI)11 og populationsudskiftning ved at manipulere værts reproduktive system12,13. Disse værtsresponser er blevet observeret i naturlige populationer af Drosophila simulans14 og i A. aegypti i et laboratoriebur og feltforsøg15. En vigtig ikke-produktiv manipulation fremkaldt af Wolbachia er induceret værtsresistens over for en række patogener, herunder DENV, Chikungunya-virus (CHIKV) og West Nile-virus (WNV)16,17, der kan medieres af et forbedret medfødt immunsystem af symbionten 18,19, konkurrence mellem Wolbachia og vira om væsentlige værtsressourcer20 og manipulation af værtsvirusforsvarsveje21 .
Denne protokol er udviklet til at studere disse underliggende mekanismer for Wolbachia-inducerede værts antivirale reaktioner. Det bruger fire metoder til påvisning af intracellulær Wolbachia-infektion af Aa23-celler. Disse metoder giver et stærkt teoretisk grundlag for undersøgelser af intracellulær Wolbachia-infektion af andre værtsarter. Den første metode, PCR – en kraftfuld teknik, der muliggør enzymatisk amplifikation af specifikke regioner af DNA uden at anvende konventionelle kloningsprocedurer – blev brugt til at detektere Wolbachia DNA og bestemme tilstedeværelsen / fraværet af Wolbachia-infektion 22. Den anden metode måler Wolbachia DNA-kopitæthed ved hjælp af kvantitativ PCR (qPCR) til pålidelig påvisning og måling af produkter genereret under hver PCR-cyklus, der er direkte proportional med mængden af skabelon før PCR23. Den tredje metode detekterer tilstedeværelsen af intracellulære Wolbachia-proteiner ved hjælp af western blot-et af de mest kraftfulde værktøjer til påvisning af specifikke proteiner i komplekse blandinger ved at kombinere elektroforesens høje separationskraft, antistoffernes specificitet og følsomheden af kromoogene enzymatiske reaktioner. Den endelige metode er et immunofluorescensassay (IFA), der kombinerer immunologi, biokemi og mikroskopi for at detektere Wolbachia-overfladeproteinet (wsp) gennem en antigen-antistofreaktion for at bekræfte den cellulære optagelse af Wolbachia og bestemme dens cellulære lokalisering.
Dette papir beskriver de fire metoder, der er anført ovenfor for at verificere eksistensen af Wolbachia i cellerne, som kan bruges til at detektere, om den eksogene Wolbachia blev transficeret med succes, og Wolbachia i cellen blev ryddet. Efter at have fastslået, om Wolbachia er til stede i cellerne eller ej, kan der udføres en række forskellige analyser, herunder genomik, proteomik eller metabolomics. Denne protokol demonstrerer påvisning af Wolbachia gennem Aa23-celler, men kan også anvendes i andre celler.
Påvisning af intracellulær Wolbachia-infektion er afgørende for undersøgelsen af Wolbachia-værtsinteraktioner og bekræftelsen af vellykket transfektion af celler med nye stammer. I denne protokol blev fire metoder anvendt til succesfuldt at detektere intracellulær Wolbachia-infektion ved nukleinsyre- og proteinniveauerne. Disse fire eksperimentelle metoder bekræftede og forbedrede detektionsnøjagtigheden af Wolbachia-infektion af celler.
PCR blev b…
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Dr. Xin-Ru Wang fra University of Minnesota for indsigtsfulde forslag og vejledning. Dette arbejde blev støttet af et tilskud fra National Natural Science Foundation of China (nr. 81760374).
Microscope | Zeiss | SteREO Discovery V8 | |
Petri dish | Fisher Scietific | FB0875713 | |
Pipette | Pipetman | F167380 | P10 |
inSituX platform | |||
Analysis software | In-house developed | ||
Cerium doped yttrium aluminum garnet | MSE Supplies | Ce:Y3Al5O12, YAG single crystal substrates | |
Chip holder | In-house developed | ||
Control software | In-house developed | ||
Immersion oil | Cargille Laboratories | 16482 | Type A low viscosity 150 cSt |
inSituX platform | In-house developed | ||
IR light source | Thorlabs Incorporated | LED1085L | LED with a Glass Lens, 1085 nm, 5 mW, TO-18 |
Outer ring | In-house developed | ||
Pump lasers | Thorlabs Incorporated | LD785-SE400 | 785 nm, 400 mW, Ø9 mm, E Pin Code, Laser Diode |
Raspberry Pi | Raspberry Pi Fundation | ||
Retaining ring | Thorlabs Incorporated | SM1RR | SM1 retaining ring for Ø1" lens tubes and mounts |
Seedless quartz crystal | University Wafers, Inc. | U01-W2-L-190514 | 25.4 mm diameter Z-cut 0.05 mm thickness double side polish 8 mm on -X |
Shim | In-house developed | ||
X-ray beam stop | In-house developed |