Påvisning af Wolbachia-stamme wAlbB i Aedes albopictus-cellelinjer
Summary
Fire metoder blev brugt til at detektere intracellulær Wolbachia, som supplerede hinanden og forbedrede detektionsnøjagtigheden af Wolbachia-infektion af Aedes albopictus-afledt Aa23 og Aa23-T helbredt af native Wolbachia-infektion ved hjælp af antibiotika.
Abstract
Som en moderligt forankret endosymbiont inficerer Wolbachia store andele af insektpopulationer. Undersøgelser har for nylig rapporteret den vellykkede regulering af RNA-virusoverførsel ved hjælp af Wolbachia-transinficerede myg. Nøglestrategier til bekæmpelse af vira inkluderer manipulation af værtsgengivelse via cytoplasmisk inkompatibilitet og hæmning af virale transkripter via immunpriming og konkurrence om værtsafledte ressourcer. Imidlertid er de underliggende mekanismer for reaktionerne fra Wolbachia-transinficerede myg til virusinfektion dårligt forstået. Dette papir præsenterer en protokol til in vitro identifikation af Wolbachia-infektion ved nukleinsyre- og proteinniveauerne i Aedes albopictus (Diptera: Culicidae) Aa23-celler for at forbedre forståelsen af interaktionerne mellem Wolbachia og dets insektvektorer. Gennem kombineret anvendelse af polymerasekædereaktion (PCR), kvantitativ PCR, western blot og immunologiske analysemetoder er der beskrevet en standardmorfologisk protokol til påvisning af Wolbachia-inficerede celler, der er mere nøjagtig end brugen af en enkelt metode. Denne fremgangsmåde kan også anvendes til påvisning af Wolbachia-infektion i andre insekttaxa.
Introduction
Den asiatiske tigermyg Aedes albopictus (Skuse) (Diptera: Culicidae), som er en nøglevektor for denguevirus (DENV) i Asien og andre dele af verden1, er en naturlig vært for to typer af de intracellulære bakterier, Wolbachia (wAlbA og wAlbB), som er fordelt over hele kimlinjen og somatisk væv 2,3. Aa23-cellelinjen afledt af A. albopictus-embryoner består af mindst to morfologiske celletyper, som begge understøtter infektion4 og kan helbredes for indfødt Wolbachia-infektion ved hjælp af antibiotika (Aa23-T). I betragtning af at Aa23 kun bevarer wAlbB, er det en nyttig model til undersøgelse af vært-endosymbiontinteraktioner 4,5,6.
Wolbachia overføres moderen og inficerer anslået 65% afinsektarterne 8,9 og 28% af myggene10. Det inficerer en række væv og danner et intimt symbiotisk forhold til værten, hvilket normalt inducerer cytoplasmisk inkompatibilitet (CI)11 og populationsudskiftning ved at manipulere værts reproduktive system12,13. Disse værtsresponser er blevet observeret i naturlige populationer af Drosophila simulans14 og i A. aegypti i et laboratoriebur og feltforsøg15. En vigtig ikke-produktiv manipulation fremkaldt af Wolbachia er induceret værtsresistens over for en række patogener, herunder DENV, Chikungunya-virus (CHIKV) og West Nile-virus (WNV)16,17, der kan medieres af et forbedret medfødt immunsystem af symbionten 18,19, konkurrence mellem Wolbachia og vira om væsentlige værtsressourcer20 og manipulation af værtsvirusforsvarsveje21 .
Denne protokol er udviklet til at studere disse underliggende mekanismer for Wolbachia-inducerede værts antivirale reaktioner. Det bruger fire metoder til påvisning af intracellulær Wolbachia-infektion af Aa23-celler. Disse metoder giver et stærkt teoretisk grundlag for undersøgelser af intracellulær Wolbachia-infektion af andre værtsarter. Den første metode, PCR – en kraftfuld teknik, der muliggør enzymatisk amplifikation af specifikke regioner af DNA uden at anvende konventionelle kloningsprocedurer – blev brugt til at detektere Wolbachia DNA og bestemme tilstedeværelsen / fraværet af Wolbachia-infektion 22. Den anden metode måler Wolbachia DNA-kopitæthed ved hjælp af kvantitativ PCR (qPCR) til pålidelig påvisning og måling af produkter genereret under hver PCR-cyklus, der er direkte proportional med mængden af skabelon før PCR23. Den tredje metode detekterer tilstedeværelsen af intracellulære Wolbachia-proteiner ved hjælp af western blot-et af de mest kraftfulde værktøjer til påvisning af specifikke proteiner i komplekse blandinger ved at kombinere elektroforesens høje separationskraft, antistoffernes specificitet og følsomheden af kromoogene enzymatiske reaktioner. Den endelige metode er et immunofluorescensassay (IFA), der kombinerer immunologi, biokemi og mikroskopi for at detektere Wolbachia-overfladeproteinet (wsp) gennem en antigen-antistofreaktion for at bekræfte den cellulære optagelse af Wolbachia og bestemme dens cellulære lokalisering.
Dette papir beskriver de fire metoder, der er anført ovenfor for at verificere eksistensen af Wolbachia i cellerne, som kan bruges til at detektere, om den eksogene Wolbachia blev transficeret med succes, og Wolbachia i cellen blev ryddet. Efter at have fastslået, om Wolbachia er til stede i cellerne eller ej, kan der udføres en række forskellige analyser, herunder genomik, proteomik eller metabolomics. Denne protokol demonstrerer påvisning af Wolbachia gennem Aa23-celler, men kan også anvendes i andre celler.
Protocol
Representative Results
Discussion
Påvisning af intracellulær Wolbachia-infektion er afgørende for undersøgelsen af Wolbachia-værtsinteraktioner og bekræftelsen af vellykket transfektion af celler med nye stammer. I denne protokol blev fire metoder anvendt til succesfuldt at detektere intracellulær Wolbachia-infektion ved nukleinsyre- og proteinniveauerne. Disse fire eksperimentelle metoder bekræftede og forbedrede detektionsnøjagtigheden af Wolbachia-infektion af celler.
PCR blev b…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Dr. Xin-Ru Wang fra University of Minnesota for indsigtsfulde forslag og vejledning. Dette arbejde blev støttet af et tilskud fra National Natural Science Foundation of China (nr. 81760374).
Materials
| Microscope | Zeiss | SteREO Discovery V8 | |
| Petri dish | Fisher Scietific | FB0875713 | |
| Pipette | Pipetman | F167380 | P10 |
| inSituX platform | |||
| Analysis software | In-house developed | ||
| Cerium doped yttrium aluminum garnet | MSE Supplies | Ce:Y3Al5O12, YAG single crystal substrates | |
| Chip holder | In-house developed | ||
| Control software | In-house developed | ||
| Immersion oil | Cargille Laboratories | 16482 | Type A low viscosity 150 cSt |
| inSituX platform | In-house developed | ||
| IR light source | Thorlabs Incorporated | LED1085L | LED with a Glass Lens, 1085 nm, 5 mW, TO-18 |
| Outer ring | In-house developed | ||
| Pump lasers | Thorlabs Incorporated | LD785-SE400 | 785 nm, 400 mW, Ø9 mm, E Pin Code, Laser Diode |
| Raspberry Pi | Raspberry Pi Fundation | ||
| Retaining ring | Thorlabs Incorporated | SM1RR | SM1 retaining ring for Ø1" lens tubes and mounts |
| Seedless quartz crystal | University Wafers, Inc. | U01-W2-L-190514 | 25.4 mm diameter Z-cut 0.05 mm thickness double side polish 8 mm on -X |
| Shim | In-house developed | ||
| X-ray beam stop | In-house developed |
Riferimenti
- Wiwatanaratanabutr, I., Kittayapong, P. I. Effects of crowding and temperature on Wolbachia infection density among life cycle stages of Aedes albopictus. Journal of Invertebrate Patholology. 102 (3), 220-224 (2009).
- Sinkins, S. P., Braig, H. R., O’Neill, S. L. Wolbachia superinfections and the expression of cytoplasmic incompatibility. Proceedings of Biologial Sciences. 261 (1362), 325-330 (1995).
- Dobson, S. L., et al. Wolbachia infections are distributed throughout insect somatic and germ line tissues. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 29 (2), 153-160 (1999).
- O’Neill, S. L., et al. In vitro cultivation of Wolbachia pipientis in an Aedes albopictus cell line. Insect Molecular Biology. 6 (1), 33-39 (1997).
- Sinha, A., Li, Z., Sun, L., Carlow, C. K. S. Complete genome sequence of the Wolbachia wAlbB endosymbiont of Aedes albopictus. Genome Biology and Evoution. 11 (3), 706-720 (2019).
- Sinkins, S. P. Wolbachia and cytoplasmic incompatibility in mosquitoes. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 34 (7), 723-729 (2004).
- Fallon, A. M. Cytological properties of an Aedes albopictus mosquito cell line infected with Wolbachia strain wAlbB. In Vitro Cellular Developmental Biology – Animals. 44 (5-6), 154-161 (2008).
- Hilgenboecker, K., Hammerstein, P., Schlattmann, P., Telschow, A., Werren, J. H. How many species are infected with Wolbachia?-A statistical analysis of current data. Microbiology Letters. 281 (2), 215-220 (2008).
- Werren, J. H., Baldo, L., Clark, M. E. Wolbachia: master manipulators of invertebrate biology. National Review of Microbiology. 6 (10), 741-751 (2008).
- Kittayapong, P., Baisley, K. J., Baimai, V., O’Neill, S. L. Distribution and diversity of Wolbachia infections in Southeast Asian mosquitoes (Diptera: Culicidae). Journal of Medical Entomology. 37 (3), 340-345 (2000).
- O’Neill, S. L., Hoffmann, A., Werren, J. . Influential passengers: inherited microorganisms and arthropod reproduction. , (1997).
- McGraw, E. A., O’Neill, S. L. Beyond insecticides: new thinking on an ancient problem. National Review of Microbiology. 11 (3), 181-193 (2013).
- Bourtzis, K., et al. Harnessing mosquito-Wolbachia symbiosis for vector and disease control. Acta Tropica. 132, 150-163 (2014).
- Turelli, M., Hoffmann, A. A. Rapid spread of an inherited incompatibility factor in California Drosophila. Nature. 353 (6343), 440-442 (1991).
- Hoffmann, A. A., et al. Successful establishment of Wolbachia in Aedes populations to suppress dengue transmission. Nature. 476 (7361), 454-457 (2011).
- Walker, T., et al. The wMel Wolbachia strain blocks dengue and invades caged Aedes aegypti populations. Nature. 476 (7361), 450-453 (2011).
- Hughes, G. L., Koga, R., Xue, P., Fukatsu, T., Rasgon, J. L. Wolbachia infections are virulent and inhibit the human malaria parasite Plasmodium falciparum in Anopheles gambiae. PLoS Pathogens. 7 (5), 1002043 (2011).
- Bian, G., Xu, Y., Lu, P., Xie, Y., Xi, Z. The endosymbiotic bacterium Wolbachia induces resistance to dengue virus in Aedes aegypti. PLoS Pathogens. 6 (4), 1000833 (2010).
- Moreira, L. A., et al. A Wolbachia symbiont in Aedes aegypti limits infection with dengue, Chikungunya, and Plasmodium. Cell. 139 (7), 1268-1278 (2009).
- Caragata, E. P., et al. Dietary cholesterol modulates pathogen blocking by Wolbachia. PLoS Pathogens. 9 (6), 1003459 (2013).
- Zhang, G., Hussain, M., O’Neill, S. L., Asgari, S. Wolbachia uses a host microRNA to regulate transcripts of a methyltransferase, contributing to dengue virus inhibition in Aedes aegypti. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (25), 10276-10281 (2013).
- Tortosa, P., Courtiol, A., Moutailler, S., Failloux, A. B., Weill, M. Chikungunya-Wolbachia interplay in Aedes albopictus. Insect Molecular Biology. 16 (7), 677-684 (2008).
- Lu, P., Bian, G., Pan, X., Xi, Z. Wolbachia induces density-dependent inhibition to dengue virus in mosquito cells. PLoS Neglected Tropical Diseases. 6 (7), 1754 (2012).
- Ghosh, A., Jasperson, D., Cohnstaedt, L. W., Brelsfoard, C. L. Transfection of Culicoides sonorensis biting midge cell lines with Wolbachia pipientis. Parasite Vectors. 12 (1), 483 (2019).
- Zhou, W., Rousset, F., O’Neill, S. Phylogeny and PCR-based classification of Wolbachia strains using wsp gene sequences. The Royal Society Publishing. Proceedings B. 265 (1395), 509-515 (1998).
- Park, M. S., Takeda, M. Cloning of PaAtg8 and roles of autophagy in adaptation to starvation with respect to the fat body and midgut of the Americana cockroach, Periplaneta americana. Cell Tissue Research. 356 (2), 405-416 (2014).
- Geng, S. C., Li, X. L., Fang, W. H. Porcine circovirus 3 capsid protein induces autophagy in HEK293T cells by inhibiting phosphorylation of the mammalian target of rapamycin. Journal of Zhejiang University Science B. 21 (7), 560-570 (2020).
- Taylor, S. C., Laperriere, G., Germain, H. Droplet digital PCR versus qPCR for gene expression analysis with low abundant targets: from variable nonsense to publication quality data. Scientific Reports. 7 (1), 2409 (2017).
- Kosea, H., Karr, T. L. Organization of Wolbachia pipientis in the Drosophila fertilized egg and embryo revealed by an anti-Wolbachia monoclonal antibody. Mechanisms of Development. 51 (2-3), 275-288 (1995).
- Ye, Y. H., et al. Wolbachia reduces the transmission potential of dengue-infected Aedes aegypti. PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (6), (2015).
- Jensenius, M., et al. Comparison of immunofluorescence, Western blotting, and cross-adsorption assays for diagnosis of African tick bite fever. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 11 (4), 786-788 (2004).
