एडीज अल्बोपिक्टस सेल लाइन्स में वोल्बाचिया स्ट्रेन डब्ल्यूएएलबीबी का पता लगाना
Summary
इंट्रासेल्युलर वोल्बाचिया का पता लगाने के लिए चार तरीकों का उपयोग किया गया था, जिसने एक-दूसरे को पूरक किया और एंटीबायोटिक दवाओं का उपयोग करके देशी वोल्बाचिया संक्रमण के एडीईएस अल्बोपिक्टस-व्युत्पन्न एए 23 और एए 23-टी के वोल्बाचिया संक्रमण की पहचान सटीकता में सुधार किया।
Abstract
मातृ रूप से परेशान एंडोसिम्बियन के रूप में, वोल्बाचिया कीट आबादी के बड़े अनुपात को संक्रमित करता है। अध्ययनों ने हाल ही में वोल्बाचिया-ट्रांसफेक्टेड मच्छरों का उपयोग करके आरएनए वायरस संचरण के सफल विनियमन की सूचना दी है। वायरस को नियंत्रित करने की प्रमुख रणनीतियों में साइटोप्लाज्मिक असंगति के माध्यम से मेजबान प्रजनन का हेरफेर और प्रतिरक्षा भड़काना और मेजबान-व्युत्पन्न संसाधनों के लिए प्रतिस्पर्धा के माध्यम से वायरल टेपों का निषेध शामिल है। हालांकि, वायरल संक्रमण के लिए वोल्बाचिया-ट्रांसफेक्टेड मच्छरों की प्रतिक्रियाओं के अंतर्निहित तंत्र को खराब समझा जाता है। यह पेपर वोल्बाचिया और इसके कीट वैक्टर के बीच बातचीत की समझ को बढ़ाने के लिए एडीज अल्बोपिक्टस (डिप्टेरा: क्यूलिसिडे) एए 23 कोशिकाओं में न्यूक्लिक एसिड और प्रोटीन के स्तर पर वोल्बाचिया संक्रमण की इन विट्रो पहचान के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है। पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर), मात्रात्मक पीसीआर, पश्चिमी धब्बा और प्रतिरक्षाविज्ञानी विश्लेषणात्मक तरीकों के संयुक्त उपयोग के माध्यम से, वोल्बाचिया-संक्रमित कोशिकाओं का पता लगाने के लिए एक मानक रूपात्मक प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है जो एक विधि के उपयोग की तुलना में अधिक सटीक है। इस दृष्टिकोण को अन्य कीट कर में वोल्बाचिया संक्रमण का पता लगाने के लिए भी लागू किया जा सकता है।
Introduction
एशियाई बाघ मच्छर एडीज अल्बोपिक्टस (स्कॉस) (डिप्टेरा: क्यूलिसिडे), जो एशिया और दुनिया के अन्य हिस्सों में डेंगू वायरस (डीईएनवी) का एक प्रमुख वेक्टर है1, दो प्रकार के इंट्रासेल्युलर बैक्टीरिया का एक प्राकृतिक मेजबान है, वोल्बाचिया (डब्ल्यूअल्बा और डब्ल्यूअल्बबी), जो रोगाणु रेखा और दैहिक ऊतक 2,3 में वितरित किए जाते हैं। अल्बोपिक्टस भ्रूण से प्राप्त एए 23 सेल लाइन में कम से कम दो रूपात्मक कोशिका प्रकार होते हैं, जिनमें से दोनों संक्रमण4 का समर्थन करते हैं और एंटीबायोटिक दवाओं (एए 23-टी) का उपयोग करके देशी वोल्बाचिया संक्रमण से ठीक हो सकते हैं। यह देखते हुए कि एए 23 केवल डब्ल्यूएल्बीबी को बरकरार रखता है, यह मेजबान-एंडोसिम्बियन इंटरैक्शन 4,5,6 के अध्ययन के लिए एक उपयोगी मॉडल है।
वोल्बाचिया मातृ रूप से प्रेषित होता है और अनुमानित 65% कीट प्रजातियों 8,9 और मच्छर प्रजातियों के 28% को संक्रमित करताहै। यह विभिन्न प्रकार के ऊतकों को संक्रमित करता है और मेजबान के साथ एक अंतरंग सहजीवी संबंध बनाता है, आमतौर पर मेजबान प्रजनन प्रणाली 12,13 में हेरफेर करके साइटोप्लाज्मिक असंगति (सीआई)11 और जनसंख्या प्रतिस्थापन को प्रेरित करता है। ये मेजबान प्रतिक्रियाएं ड्रोसोफिला सिमुलन्स14 की प्राकृतिक आबादी में और प्रयोगशाला पिंजरे और फील्ड ट्रायल15 में ए एजिप्टी में देखी गई हैं। वोल्बाचिया द्वारा प्राप्त एक महत्वपूर्ण अनुत्पादक हेरफेर डेनवी, चिकनगुनिया वायरस (सीएचआईकेवी), और वेस्ट नाइल वायरस (डब्ल्यूएनवी) 16,17 सहित विभिन्न रोगजनकों के लिए मेजबान प्रतिरोध को प्रेरित करता है, जिसे सहजीवन18,19 की बेहतर जन्मजात प्रतिरक्षा प्रणाली द्वारा मध्यस्थता की जा सकती है, आवश्यक मेजबान संसाधनों के लिए वोल्बाचिया और वायरस के बीच प्रतिस्पर्धा20, और मेजबान वायरल रक्षा मार्गों का हेरफेर .
यह प्रोटोकॉल वोल्बाचिया-प्रेरित मेजबान एंटीवायरल प्रतिक्रियाओं के इन अंतर्निहित तंत्रों का अध्ययन करने के लिए विकसित किया गया है। यह एए 23 कोशिकाओं के इंट्रासेल्युलर वोल्बाचिया संक्रमण का पता लगाने के चार तरीकों का उपयोग करता है। ये विधियां अन्य मेजबान प्रजातियों के इंट्रासेल्युलर वोल्बाचिया संक्रमण के अध्ययन के लिए एक मजबूत सैद्धांतिक आधार प्रदान करती हैं। पहली विधि, पीसीआर-पारंपरिक क्लोनिंग प्रक्रियाओं का उपयोग किए बिना डीएनए के विशिष्ट क्षेत्रों के एंजाइमी प्रवर्धन की अनुमति देने वाली एक शक्तिशाली तकनीक- वोल्बाचिया डीएनए का पता लगाने और वोल्बाचिया संक्रमण22 की उपस्थिति / दूसरी विधि प्रत्येक पीसीआर चक्र के दौरान उत्पन्न उत्पादों का विश्वसनीय पता लगाने और माप के लिए मात्रात्मक पीसीआर (क्यूपीसीआर) का उपयोग करके वोल्बाचिया डीएनए कॉपी घनत्व को मापती है जो पीसीआर23 से पहले टेम्पलेट की मात्रा के सीधे आनुपातिक है। तीसरी विधि इंट्रासेल्युलर वोल्बाचिया प्रोटीन की उपस्थिति का पता लगाती है, पश्चिमी धब्बा का उपयोग करके- वैद्युतकणसंचलन की उच्च पृथक्करण शक्ति, एंटीबॉडी की विशिष्टता और क्रोमोजेनिक एंजाइमेटिक प्रतिक्रियाओं की संवेदनशीलता के संयोजन से जटिल मिश्रण में विशिष्ट प्रोटीन का पता लगाने के लिए सबसे शक्तिशाली उपकरणों में से एक। अंतिम विधि एक इम्यूनोफ्लोरेसेंस परख (आईएफए) है जो वोल्बाचिया के सेलुलर उत्थान की पुष्टि करने और इसके सेलुलर स्थानीयकरण को निर्धारित करने के लिए एंटीजन-एंटीबॉडी प्रतिक्रिया के माध्यम से वोल्बाचिया सतह प्रोटीन (डब्ल्यूएसपी) का पता लगाने के लिए इम्यूनोलॉजी , जैव रसायन और माइक्रोस्कोपी को जोड़ती है।
यह पत्र कोशिकाओं में वोल्बाचिया के अस्तित्व को सत्यापित करने के लिए ऊपर सूचीबद्ध चार तरीकों का वर्णन करता है, जिसका उपयोग यह पता लगाने के लिए किया जा सकता है कि क्या बहिर्जात वोल्बाचिया सफलतापूर्वक ट्रांसफेक्टेड था और सेल में वोल्बाचिया को मंजूरी दे दी गई थी। यह निर्धारित करने के बाद कि वोल्बाचिया कोशिकाओं में मौजूद है या नहीं, जीनोमिक्स, प्रोटिओमिक्स या मेटाबोलॉमिक्स सहित विभिन्न विश्लेषण किए जा सकते हैं। यह प्रोटोकॉल एए 23 कोशिकाओं के माध्यम से वोल्बाचिया का पता लगाने को दर्शाता है लेकिन अन्य कोशिकाओं में भी इस्तेमाल किया जा सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
वोल्बाचिया-होस्ट इंटरैक्शन के अध्ययन और उपन्यास उपभेदों के साथ कोशिकाओं के सफल अभिकर्मक की पुष्टि के लिए इंट्रासेल्युलर वोल्बाचिया संक्रमण का पता लगाना आवश्यक है। इस प्रोटोकॉल में, न्यूक्लि?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम व्यावहारिक सुझावों और मार्गदर्शन के लिए मिनेसोटा विश्वविद्यालय के डॉ शिन-रू वांग को धन्यवाद देते हैं। इस काम को चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (नंबर 81760374) के अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| Microscope | Zeiss | SteREO Discovery V8 | |
| Petri dish | Fisher Scietific | FB0875713 | |
| Pipette | Pipetman | F167380 | P10 |
| inSituX platform | |||
| Analysis software | In-house developed | ||
| Cerium doped yttrium aluminum garnet | MSE Supplies | Ce:Y3Al5O12, YAG single crystal substrates | |
| Chip holder | In-house developed | ||
| Control software | In-house developed | ||
| Immersion oil | Cargille Laboratories | 16482 | Type A low viscosity 150 cSt |
| inSituX platform | In-house developed | ||
| IR light source | Thorlabs Incorporated | LED1085L | LED with a Glass Lens, 1085 nm, 5 mW, TO-18 |
| Outer ring | In-house developed | ||
| Pump lasers | Thorlabs Incorporated | LD785-SE400 | 785 nm, 400 mW, Ø9 mm, E Pin Code, Laser Diode |
| Raspberry Pi | Raspberry Pi Fundation | ||
| Retaining ring | Thorlabs Incorporated | SM1RR | SM1 retaining ring for Ø1" lens tubes and mounts |
| Seedless quartz crystal | University Wafers, Inc. | U01-W2-L-190514 | 25.4 mm diameter Z-cut 0.05 mm thickness double side polish 8 mm on -X |
| Shim | In-house developed | ||
| X-ray beam stop | In-house developed |
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