Detektera Wolbachia Strain wAlbB i Aedes albopictus cellinjer
Summary
Fyra metoder användes för att detektera intracellulär Wolbachia, som kompletterade varandra och förbättrade detektionsnoggrannheten för Wolbachia-infektion av Aedes albopictus-härledd Aa23 och Aa23-T botad av infödd Wolbachia-infektion med antibiotika.
Abstract
Som en moderligt hyst endosymbiont infekterar Wolbachia stora andelar av insektspopulationer. Studier har nyligen rapporterat den framgångsrika regleringen av RNA-virusöverföring med Wolbachia-transinfekterade myggor. Viktiga strategier för att kontrollera virus inkluderar manipulation av värdreproduktion via cytoplasmatisk inkompatibilitet och hämning av virala transkript via immunpriming och konkurrens om värd-härledda resurser. De underliggande mekanismerna för Svaren från Wolbachia-transfekterade myggor på virusinfektion är dock dåligt förstådda. Denna uppsats presenterar ett protokoll för in vitro-identifiering av Wolbachia-infektion vid nukleinsyra- och proteinnivåerna i Aedes albopictus (Diptera: Culicidae) Aa23-celler för att förbättra förståelsen av interaktionerna mellan Wolbachia och dess insektsvektorer. Genom kombinerad användning av polymeraskedjereaktion (PCR), kvantitativa PCR-, western blot- och immunologiska analysmetoder har ett standardmorfologiskt protokoll beskrivits för detektion av Wolbachia-infekterade celler som är mer exakt än användningen av en enda metod. Detta tillvägagångssätt kan också tillämpas på detektion av Wolbachia-infektion i andra insektstaxa.
Introduction
Den asiatiska tigermyggan Aedes albopictus (Skuse) (Diptera: Culicidae), som är en nyckelvektor för denguevirus (DENV) i Asien och andra delar av världen1, är en naturlig värd för två typer av de intracellulära bakterierna, Wolbachia (wAlbA och wAlbB), som fördelas över bakterielinjen och somatisk vävnad 2,3. Aa23-cellinjen som härrör från A. albopictus-embryon består av minst två morfologiska celltyper, som båda stöder infektion4 och kan botas av infödd Wolbachia-infektion med antibiotika (Aa23-T). Med tanke på att Aa23 endast behåller wAlbB är det en användbar modell för studier av värd-endosymbiontinteraktioner 4,5,6.
Wolbachia överförs maternellt och infekterar uppskattningsvis 65% avinsektsarterna 8,9 och 28% avmyggarterna 10. Det infekterar en mängd olika vävnader och bildar ett intimt symbiotiskt förhållande med värden, vilket vanligtvis inducerar cytoplasmatisk inkompatibilitet (CI)11 och befolkningsersättning genom att manipulera värdens reproduktionssystem12,13. Dessa värdsvar har observerats i naturliga populationer av Drosophila simulans14 och i A. aegypti i en laboratoriebur och fältförsök15. En viktig icke-produktiv manipulation som framkallas av Wolbachia induceras värdresistens mot en mängd olika patogener, inklusive DENV, Chikungunya-virus (CHIKV) och West Nile-virus (WNV)16,17, som kan förmedlas av ett förbättrat medfött immunsystem av symbionten18,19, konkurrens mellan Wolbachia och virus för viktiga värdresurser20 och manipulation av värdvirala försvarsvägar21 .
Detta protokoll har utvecklats för att studera dessa underliggande mekanismer för Wolbachia-inducerade värd antivirala svar. Den använder fyra metoder för detektion av intracellulär Wolbachia-infektion av Aa23-celler. Dessa metoder ger en stark teoretisk grund för studier av intracellulär Wolbachiainfektion hos andra värdarter. Den första metoden, PCR – en kraftfull teknik som möjliggör enzymatisk förstärkning av specifika dna-regioner utan att använda konventionella kloningsförfaranden – användes för att detektera Wolbachia-DNA och bestämma närvaron / frånvaron av Wolbachia-infektion 22. Den andra metoden mäter Wolbachia DNA-kopieringstäthet med hjälp av kvantitativ PCR (qPCR) för tillförlitlig detektion och mätning av produkter som genereras under varje PCR-cykel som står i direkt proportion till mängden mall före PCR23. Den tredje metoden detekterar närvaron av intracellulära Wolbachia-proteiner , med användning av western blot-ett av de mest kraftfulla verktygen för att detektera specifika proteiner i komplexa blandningar genom att kombinera elektrofores höga separationskraft, antikropparnas specificitet och känsligheten hos kromogena enzymatiska reaktioner. Den slutliga metoden är en immunofluorescensanalys (IFA) som kombinerar immunologi, biokemi och mikroskopi för att detektera Wolbachia-ytproteinet (wsp) genom en antigen-antikroppsreaktion för att bekräfta det cellulära upptaget av Wolbachia och bestämma dess cellulära lokalisering.
Detta dokument beskriver de fyra metoderna som anges ovan för att verifiera förekomsten av Wolbachia i cellerna, som kan användas för att upptäcka om den exogena Wolbachia framgångsrikt transfekterades och Wolbachia i cellen rensades. Efter att ha bestämt om Wolbachia finns i cellerna eller inte kan en mängd olika analyser utföras, inklusive genomik, proteomik eller metabolomik. Detta protokoll visar detektion av Wolbachia genom Aa23-celler men kan också användas i andra celler.
Protocol
Representative Results
Discussion
Detektion av intracellulär Wolbachia-infektion är avgörande för studier av Wolbachia-värdinteraktioner och bekräftelse av framgångsrik transfektion av celler med nya stammar. I detta protokoll användes fyra metoder för att framgångsrikt detektera intracellulär Wolbachia-infektion vid nukleinsyra- och proteinnivåerna. Dessa fyra experimentella metoder bekräftade och förbättrade detektionsnoggrannheten för Wolbachia-infektion av celler.
PCR an…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Dr. Xin-Ru Wang från University of Minnesota för insiktsfulla förslag och vägledning. Detta arbete stöddes av ett bidrag från National Natural Science Foundation of China (No.81760374).
Materials
| Microscope | Zeiss | SteREO Discovery V8 | |
| Petri dish | Fisher Scietific | FB0875713 | |
| Pipette | Pipetman | F167380 | P10 |
| inSituX platform | |||
| Analysis software | In-house developed | ||
| Cerium doped yttrium aluminum garnet | MSE Supplies | Ce:Y3Al5O12, YAG single crystal substrates | |
| Chip holder | In-house developed | ||
| Control software | In-house developed | ||
| Immersion oil | Cargille Laboratories | 16482 | Type A low viscosity 150 cSt |
| inSituX platform | In-house developed | ||
| IR light source | Thorlabs Incorporated | LED1085L | LED with a Glass Lens, 1085 nm, 5 mW, TO-18 |
| Outer ring | In-house developed | ||
| Pump lasers | Thorlabs Incorporated | LD785-SE400 | 785 nm, 400 mW, Ø9 mm, E Pin Code, Laser Diode |
| Raspberry Pi | Raspberry Pi Fundation | ||
| Retaining ring | Thorlabs Incorporated | SM1RR | SM1 retaining ring for Ø1" lens tubes and mounts |
| Seedless quartz crystal | University Wafers, Inc. | U01-W2-L-190514 | 25.4 mm diameter Z-cut 0.05 mm thickness double side polish 8 mm on -X |
| Shim | In-house developed | ||
| X-ray beam stop | In-house developed |
Riferimenti
- Wiwatanaratanabutr, I., Kittayapong, P. I. Effects of crowding and temperature on Wolbachia infection density among life cycle stages of Aedes albopictus. Journal of Invertebrate Patholology. 102 (3), 220-224 (2009).
- Sinkins, S. P., Braig, H. R., O’Neill, S. L. Wolbachia superinfections and the expression of cytoplasmic incompatibility. Proceedings of Biologial Sciences. 261 (1362), 325-330 (1995).
- Dobson, S. L., et al. Wolbachia infections are distributed throughout insect somatic and germ line tissues. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 29 (2), 153-160 (1999).
- O’Neill, S. L., et al. In vitro cultivation of Wolbachia pipientis in an Aedes albopictus cell line. Insect Molecular Biology. 6 (1), 33-39 (1997).
- Sinha, A., Li, Z., Sun, L., Carlow, C. K. S. Complete genome sequence of the Wolbachia wAlbB endosymbiont of Aedes albopictus. Genome Biology and Evoution. 11 (3), 706-720 (2019).
- Sinkins, S. P. Wolbachia and cytoplasmic incompatibility in mosquitoes. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 34 (7), 723-729 (2004).
- Fallon, A. M. Cytological properties of an Aedes albopictus mosquito cell line infected with Wolbachia strain wAlbB. In Vitro Cellular Developmental Biology – Animals. 44 (5-6), 154-161 (2008).
- Hilgenboecker, K., Hammerstein, P., Schlattmann, P., Telschow, A., Werren, J. H. How many species are infected with Wolbachia?-A statistical analysis of current data. Microbiology Letters. 281 (2), 215-220 (2008).
- Werren, J. H., Baldo, L., Clark, M. E. Wolbachia: master manipulators of invertebrate biology. National Review of Microbiology. 6 (10), 741-751 (2008).
- Kittayapong, P., Baisley, K. J., Baimai, V., O’Neill, S. L. Distribution and diversity of Wolbachia infections in Southeast Asian mosquitoes (Diptera: Culicidae). Journal of Medical Entomology. 37 (3), 340-345 (2000).
- O’Neill, S. L., Hoffmann, A., Werren, J. . Influential passengers: inherited microorganisms and arthropod reproduction. , (1997).
- McGraw, E. A., O’Neill, S. L. Beyond insecticides: new thinking on an ancient problem. National Review of Microbiology. 11 (3), 181-193 (2013).
- Bourtzis, K., et al. Harnessing mosquito-Wolbachia symbiosis for vector and disease control. Acta Tropica. 132, 150-163 (2014).
- Turelli, M., Hoffmann, A. A. Rapid spread of an inherited incompatibility factor in California Drosophila. Nature. 353 (6343), 440-442 (1991).
- Hoffmann, A. A., et al. Successful establishment of Wolbachia in Aedes populations to suppress dengue transmission. Nature. 476 (7361), 454-457 (2011).
- Walker, T., et al. The wMel Wolbachia strain blocks dengue and invades caged Aedes aegypti populations. Nature. 476 (7361), 450-453 (2011).
- Hughes, G. L., Koga, R., Xue, P., Fukatsu, T., Rasgon, J. L. Wolbachia infections are virulent and inhibit the human malaria parasite Plasmodium falciparum in Anopheles gambiae. PLoS Pathogens. 7 (5), 1002043 (2011).
- Bian, G., Xu, Y., Lu, P., Xie, Y., Xi, Z. The endosymbiotic bacterium Wolbachia induces resistance to dengue virus in Aedes aegypti. PLoS Pathogens. 6 (4), 1000833 (2010).
- Moreira, L. A., et al. A Wolbachia symbiont in Aedes aegypti limits infection with dengue, Chikungunya, and Plasmodium. Cell. 139 (7), 1268-1278 (2009).
- Caragata, E. P., et al. Dietary cholesterol modulates pathogen blocking by Wolbachia. PLoS Pathogens. 9 (6), 1003459 (2013).
- Zhang, G., Hussain, M., O’Neill, S. L., Asgari, S. Wolbachia uses a host microRNA to regulate transcripts of a methyltransferase, contributing to dengue virus inhibition in Aedes aegypti. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (25), 10276-10281 (2013).
- Tortosa, P., Courtiol, A., Moutailler, S., Failloux, A. B., Weill, M. Chikungunya-Wolbachia interplay in Aedes albopictus. Insect Molecular Biology. 16 (7), 677-684 (2008).
- Lu, P., Bian, G., Pan, X., Xi, Z. Wolbachia induces density-dependent inhibition to dengue virus in mosquito cells. PLoS Neglected Tropical Diseases. 6 (7), 1754 (2012).
- Ghosh, A., Jasperson, D., Cohnstaedt, L. W., Brelsfoard, C. L. Transfection of Culicoides sonorensis biting midge cell lines with Wolbachia pipientis. Parasite Vectors. 12 (1), 483 (2019).
- Zhou, W., Rousset, F., O’Neill, S. Phylogeny and PCR-based classification of Wolbachia strains using wsp gene sequences. The Royal Society Publishing. Proceedings B. 265 (1395), 509-515 (1998).
- Park, M. S., Takeda, M. Cloning of PaAtg8 and roles of autophagy in adaptation to starvation with respect to the fat body and midgut of the Americana cockroach, Periplaneta americana. Cell Tissue Research. 356 (2), 405-416 (2014).
- Geng, S. C., Li, X. L., Fang, W. H. Porcine circovirus 3 capsid protein induces autophagy in HEK293T cells by inhibiting phosphorylation of the mammalian target of rapamycin. Journal of Zhejiang University Science B. 21 (7), 560-570 (2020).
- Taylor, S. C., Laperriere, G., Germain, H. Droplet digital PCR versus qPCR for gene expression analysis with low abundant targets: from variable nonsense to publication quality data. Scientific Reports. 7 (1), 2409 (2017).
- Kosea, H., Karr, T. L. Organization of Wolbachia pipientis in the Drosophila fertilized egg and embryo revealed by an anti-Wolbachia monoclonal antibody. Mechanisms of Development. 51 (2-3), 275-288 (1995).
- Ye, Y. H., et al. Wolbachia reduces the transmission potential of dengue-infected Aedes aegypti. PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (6), (2015).
- Jensenius, M., et al. Comparison of immunofluorescence, Western blotting, and cross-adsorption assays for diagnosis of African tick bite fever. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 11 (4), 786-788 (2004).
