Fyra metoder användes för att detektera intracellulär Wolbachia, som kompletterade varandra och förbättrade detektionsnoggrannheten för Wolbachia-infektion av Aedes albopictus-härledd Aa23 och Aa23-T botad av infödd Wolbachia-infektion med antibiotika.
Som en moderligt hyst endosymbiont infekterar Wolbachia stora andelar av insektspopulationer. Studier har nyligen rapporterat den framgångsrika regleringen av RNA-virusöverföring med Wolbachia-transinfekterade myggor. Viktiga strategier för att kontrollera virus inkluderar manipulation av värdreproduktion via cytoplasmatisk inkompatibilitet och hämning av virala transkript via immunpriming och konkurrens om värd-härledda resurser. De underliggande mekanismerna för Svaren från Wolbachia-transfekterade myggor på virusinfektion är dock dåligt förstådda. Denna uppsats presenterar ett protokoll för in vitro-identifiering av Wolbachia-infektion vid nukleinsyra- och proteinnivåerna i Aedes albopictus (Diptera: Culicidae) Aa23-celler för att förbättra förståelsen av interaktionerna mellan Wolbachia och dess insektsvektorer. Genom kombinerad användning av polymeraskedjereaktion (PCR), kvantitativa PCR-, western blot- och immunologiska analysmetoder har ett standardmorfologiskt protokoll beskrivits för detektion av Wolbachia-infekterade celler som är mer exakt än användningen av en enda metod. Detta tillvägagångssätt kan också tillämpas på detektion av Wolbachia-infektion i andra insektstaxa.
Den asiatiska tigermyggan Aedes albopictus (Skuse) (Diptera: Culicidae), som är en nyckelvektor för denguevirus (DENV) i Asien och andra delar av världen1, är en naturlig värd för två typer av de intracellulära bakterierna, Wolbachia (wAlbA och wAlbB), som fördelas över bakterielinjen och somatisk vävnad 2,3. Aa23-cellinjen som härrör från A. albopictus-embryon består av minst två morfologiska celltyper, som båda stöder infektion4 och kan botas av infödd Wolbachia-infektion med antibiotika (Aa23-T). Med tanke på att Aa23 endast behåller wAlbB är det en användbar modell för studier av värd-endosymbiontinteraktioner 4,5,6.
Wolbachia överförs maternellt och infekterar uppskattningsvis 65% avinsektsarterna 8,9 och 28% avmyggarterna 10. Det infekterar en mängd olika vävnader och bildar ett intimt symbiotiskt förhållande med värden, vilket vanligtvis inducerar cytoplasmatisk inkompatibilitet (CI)11 och befolkningsersättning genom att manipulera värdens reproduktionssystem12,13. Dessa värdsvar har observerats i naturliga populationer av Drosophila simulans14 och i A. aegypti i en laboratoriebur och fältförsök15. En viktig icke-produktiv manipulation som framkallas av Wolbachia induceras värdresistens mot en mängd olika patogener, inklusive DENV, Chikungunya-virus (CHIKV) och West Nile-virus (WNV)16,17, som kan förmedlas av ett förbättrat medfött immunsystem av symbionten18,19, konkurrens mellan Wolbachia och virus för viktiga värdresurser20 och manipulation av värdvirala försvarsvägar21 .
Detta protokoll har utvecklats för att studera dessa underliggande mekanismer för Wolbachia-inducerade värd antivirala svar. Den använder fyra metoder för detektion av intracellulär Wolbachia-infektion av Aa23-celler. Dessa metoder ger en stark teoretisk grund för studier av intracellulär Wolbachiainfektion hos andra värdarter. Den första metoden, PCR – en kraftfull teknik som möjliggör enzymatisk förstärkning av specifika dna-regioner utan att använda konventionella kloningsförfaranden – användes för att detektera Wolbachia-DNA och bestämma närvaron / frånvaron av Wolbachia-infektion 22. Den andra metoden mäter Wolbachia DNA-kopieringstäthet med hjälp av kvantitativ PCR (qPCR) för tillförlitlig detektion och mätning av produkter som genereras under varje PCR-cykel som står i direkt proportion till mängden mall före PCR23. Den tredje metoden detekterar närvaron av intracellulära Wolbachia-proteiner , med användning av western blot-ett av de mest kraftfulla verktygen för att detektera specifika proteiner i komplexa blandningar genom att kombinera elektrofores höga separationskraft, antikropparnas specificitet och känsligheten hos kromogena enzymatiska reaktioner. Den slutliga metoden är en immunofluorescensanalys (IFA) som kombinerar immunologi, biokemi och mikroskopi för att detektera Wolbachia-ytproteinet (wsp) genom en antigen-antikroppsreaktion för att bekräfta det cellulära upptaget av Wolbachia och bestämma dess cellulära lokalisering.
Detta dokument beskriver de fyra metoderna som anges ovan för att verifiera förekomsten av Wolbachia i cellerna, som kan användas för att upptäcka om den exogena Wolbachia framgångsrikt transfekterades och Wolbachia i cellen rensades. Efter att ha bestämt om Wolbachia finns i cellerna eller inte kan en mängd olika analyser utföras, inklusive genomik, proteomik eller metabolomik. Detta protokoll visar detektion av Wolbachia genom Aa23-celler men kan också användas i andra celler.
Detektion av intracellulär Wolbachia-infektion är avgörande för studier av Wolbachia-värdinteraktioner och bekräftelse av framgångsrik transfektion av celler med nya stammar. I detta protokoll användes fyra metoder för att framgångsrikt detektera intracellulär Wolbachia-infektion vid nukleinsyra- och proteinnivåerna. Dessa fyra experimentella metoder bekräftade och förbättrade detektionsnoggrannheten för Wolbachia-infektion av celler.
PCR an…
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Dr. Xin-Ru Wang från University of Minnesota för insiktsfulla förslag och vägledning. Detta arbete stöddes av ett bidrag från National Natural Science Foundation of China (No.81760374).
Microscope | Zeiss | SteREO Discovery V8 | |
Petri dish | Fisher Scietific | FB0875713 | |
Pipette | Pipetman | F167380 | P10 |
inSituX platform | |||
Analysis software | In-house developed | ||
Cerium doped yttrium aluminum garnet | MSE Supplies | Ce:Y3Al5O12, YAG single crystal substrates | |
Chip holder | In-house developed | ||
Control software | In-house developed | ||
Immersion oil | Cargille Laboratories | 16482 | Type A low viscosity 150 cSt |
inSituX platform | In-house developed | ||
IR light source | Thorlabs Incorporated | LED1085L | LED with a Glass Lens, 1085 nm, 5 mW, TO-18 |
Outer ring | In-house developed | ||
Pump lasers | Thorlabs Incorporated | LD785-SE400 | 785 nm, 400 mW, Ø9 mm, E Pin Code, Laser Diode |
Raspberry Pi | Raspberry Pi Fundation | ||
Retaining ring | Thorlabs Incorporated | SM1RR | SM1 retaining ring for Ø1" lens tubes and mounts |
Seedless quartz crystal | University Wafers, Inc. | U01-W2-L-190514 | 25.4 mm diameter Z-cut 0.05 mm thickness double side polish 8 mm on -X |
Shim | In-house developed | ||
X-ray beam stop | In-house developed |