प्रोटीन और हाइड्रेशन पानी के पिकोसेकंड-नैनोसेकंड डायनामिक्स का अध्ययन करने के लिए उच्च-रिज़ॉल्यूशन न्यूट्रॉन स्पेक्ट्रोस्कोपी

Summary

न्यूट्रॉन बैकस्कैटरिंग स्पेक्ट्रोस्कोपी प्रोटीन और उनके हाइड्रेशन पानी के पीएस-एनएस गतिशीलता के लिए एक गैर-विनाशकारी और लेबल-मुक्त पहुंच प्रदान करता है। वर्कफ़्लो को एमिलॉयड प्रोटीन पर दो अध्ययनों के साथ प्रस्तुत किया गया है: एकत्रीकरण के दौरान लाइसोजाइम की समय-हल गतिशीलता पर और फाइबर गठन पर ताऊ के जलयोजन जल गतिशीलता पर।

Abstract

न्यूट्रॉन प्रकीर्णन एक गैर-विनाशकारी तरीके से और ड्यूटेरियम के अलावा अन्य लेबलिंग के बिना ऊर्जा की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए नमूनों के भीतर गतिशीलता की जांच करने की संभावना प्रदान करता है। विशेष रूप से, न्यूट्रॉन बैकस्कैटरिंग स्पेक्ट्रोस्कोपी एक साथ कई प्रकीर्णन कोणों पर प्रकीर्णन संकेतों को रिकॉर्ड करता है और पीएस-एनएस टाइमस्केल पर जैविक प्रणालियों की गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है। डी₂ओ-और संभवतः ड्यूरेटेड बफर घटकों को नियोजित करके- विधि तरल अवस्था में प्रोटीन के केंद्र-द्रव्यमान प्रसार और रीढ़ और साइड-चेन गति (आंतरिक गतिशीलता) दोनों की निगरानी की अनुमति देती है।

इसके अतिरिक्त, हाइड्रेशन पानी की गतिशीलता का अध्ययन एच₂ओ के साथ हाइड्रेटेड परड्यूरेटेड प्रोटीन के पाउडर को नियोजित करके किया जा सकता है। यह पेपर प्रोटीन और हाइड्रेशन पानी की गतिशीलता की जांच के लिए इंस्टीट्यूट लाउ-लैंगविन (आईएल) में उपकरण आईएन 16 बी पर नियोजित वर्कफ़्लो प्रस्तुत करता है। वाष्प विनिमय का उपयोग करके समाधान नमूने और हाइड्रेटेड प्रोटीन पाउडर के नमूने तैयार करने को समझाया गया है। प्रोटीन और हाइड्रेशन पानी की गतिशीलता दोनों के लिए डेटा विश्लेषण प्रक्रिया विभिन्न प्रकार के डेटासेट (क्वासिइलास्टिक स्पेक्ट्रा या फिक्स्ड-विंडो स्कैन) के लिए वर्णित है जिसे न्यूट्रॉन बैकस्कैटरिंग स्पेक्ट्रोमीटर पर प्राप्त किया जा सकता है।

विधि को अमाइलॉइड प्रोटीन से जुड़े दो अध्ययनों के साथ चित्रित किया गया है। लाइसोजाइम का एकत्रीकरण μm आकार के गोलाकार समुच्चय-निरूपित कणों में होता है- IN16B पर जांच की गई अंतरिक्ष और समय सीमा पर एक-चरण यी प्रक्रिया में होता है, जबकि आंतरिक गतिशीलता अपरिवर्तित रहती है। इसके अलावा, ताऊ के हाइड्रेशन पानी की गतिशीलता का अध्ययन परड्यूरेटेड प्रोटीन के हाइड्रेटेड पाउडर पर किया गया था। यह दिखाया गया है कि अमाइलॉइड फाइबर के गठन पर पानी की ट्रांसलेशनल गतियां सक्रिय होती हैं। अंत में, प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण चरणों पर चर्चा की जाती है कि अन्य प्रयोगात्मक बायोफिज़िकल विधियों के संबंध में गतिशीलता के अध्ययन के संबंध में न्यूट्रॉन प्रकीर्णन कैसे तैनात किया जाता है।

Introduction

न्यूट्रॉन एक चार्ज-लेस और विशाल कण है जिसका उपयोग मौलिक भौतिकी से जीव विज्ञान¹ तक विभिन्न क्षेत्रों में नमूनों की जांच के लिए वर्षों से सफलतापूर्वक किया गया है। जैविक अनुप्रयोगों के लिए, छोटे-कोण न्यूट्रॉन प्रकीर्णन, इनलेस्टिक न्यूट्रॉन प्रकीर्णन, और न्यूट्रॉन क्रिस्टलोग्राफी और रिफ्लेक्टोमेट्री का बड़े पैमाने^{पर उपयोग किया} जाता है2,3,4। इनलेस्टिक न्यूट्रॉन प्रकीर्णन विशिष्ट लेबलिंग की आवश्यकता के बिना गतिशीलता का एक पहनावा-औसत माप प्रदान करता है, और एक संकेत गुणवत्ता जो आकार या प्रोटीन⁵ पर निर्भर नहीं करती है। माप अध्ययन के तहत प्रोटीन के लिए एक अत्यधिक जटिल वातावरण का उपयोग करके किया जा सकता है जो इंट्रासेल्युलर माध्यम की नकल करता है, जैसे कि ड्यूरेटेड बैक्टीरियल लाइसेट या यहां तक कि विवो ^3,6,7 में भी। गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए विभिन्न प्रयोगात्मक सेटअपों का उपयोग किया जा सकता है, अर्थात् i) उड़ान का समय-उप-पीएस-पीएस गतिशीलता तक पहुंच प्रदान करना, ii) बैकस्कैटरिंग-पीएस-एनएस गतिशीलता तक पहुंच प्रदान करना, और iii) स्पिन-इको-एनएस से सैकड़ों एनएस तक गतिशीलता तक पहुंच प्रदान करना। न्यूट्रॉन बैकस्कैटरिंग ब्रैग के नियम 2 d sinø = n’ का उपयोग करता है, जहां d एक क्रिस्टल में विमानों के बीच की दूरी है, प्रकीर्णन कोण, n प्रकीर्णन क्रम और o तरंग दैर्ध्य है। डिटेक्टरों की ओर बैकस्कैटरिंग के लिए क्रिस्टल का उपयोग ऊर्जा में उच्च रिज़ॉल्यूशन प्राप्त करने की अनुमति देता है, आमतौर पर ~ 0.8 μeV। ऊर्जा विनिमय को मापने के लिए, या तो बैकस्कैटरिंग में एक क्रिस्टल ले जाने वाले डॉपलर ड्राइव का उपयोग आने वाले न्यूट्रॉन तरंग दैर्ध्य 8,9,10 (चित्रा 1) को परिभाषित करने और ट्यून करने के लिए किया जाता है^, या ऊर्जा रिज़ॉल्यूशन¹¹ में कमी की कीमत पर टाइम-ऑफ-फ्लाइट सेटअप का उपयोग किया जा सकता है।

चित्रा 1: डॉपलर ड्राइव के साथ न्यूट्रॉन बैकस्कैटरिंग स्पेक्ट्रोमीटर का स्केच। आने वाली बीम फेज स्पेस ट्रांसफॉर्मेशन (पीएसटी) हेलिकॉप्टर⁴² से टकराती है, जो सैंपल पोजिशन पर फ्लक्स को बढ़ा देती है। फिर इसे डॉपलर ड्राइव द्वारा नमूने की ओर वापस बिखेर दिया जाता है, जो एक ऊर्जा ई₁ (सियान तीर) का चयन करता है। न्यूट्रॉन तब नमूने द्वारा बिखरे हुए होते हैं (तीर ों के रंग द्वारा दर्शाए गए विभिन्न ऊर्जाओं के साथ) और एसआई 111 क्रिस्टल से बने विश्लेषक, केवल एक विशिष्ट ऊर्जा ई₀ (लाल रंग के तीर यहां) के साथ न्यूट्रॉन को बैकस्कैटर करेंगे। इसलिए, संवेग स्थानांतरण क्यू डिटेक्टर सरणी पर न्यूट्रॉन की पता लगाई गई स्थिति से प्राप्त किया जाता है, और ऊर्जा हस्तांतरण अंतर ई₁– ई₀ से प्राप्त किया जाता है। पीएसटी द्वारा उत्पादित न्यूट्रॉन पल्स के लिए अपेक्षित उड़ान के समय का उपयोग डिटेक्टर ट्यूबों की ओर सीधे बिखरे न्यूट्रॉन से सिग्नल को त्यागने के लिए किया जाता है। संक्षिप्त नाम: पीएसटी = चरण अंतरिक्ष परिवर्तन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

बैकस्कैटरिंग स्पेक्ट्रोस्कोपी के लिए, हाइड्रोजन प्रोटॉन युक्त नमूने, जैसे प्रोटीन से संकेत में मुख्य योगदान असंगत प्रकीर्णन से आता है, जिसके लिए प्रकीर्णन तीव्रता एस_इंक (क्यू, ) को ईक्यू (1)¹² द्वारा दिखाया गया है।

(1)

जहाँ σ_इंक तत्व का असंगत क्रॉस-सेक्शन माना जाता है, k बिखरे हुए वेववेक्टर का आदर्श है, k आने वाले वेववेक्टर का आदर्श है, q (= k – k’) संवेग अंतरण, r j(t) समय t पर परमाणु _j का स्थिति वेक्टर है, और आने वाले न्यूट्रॉन और सिस्टम के बीच ऊर्जा हस्तांतरण के अनुरूप आवृत्ति है। कोणीय कोष्ठक पहनावा औसत को दर्शाता है। इसलिए, असंगत प्रकीर्णन समय के साथ परमाणु स्थितियों के समरूप-औसत एकल-कण आत्म-सहसंबंध की जांच करता है और सिस्टम में सभी परमाणुओं और विभिन्न समय उत्पत्ति (पहनावा औसत) पर औसत आत्म-गतिशीलता देता है। प्रकीर्णन फ़ंक्शन मध्यवर्ती प्रकीर्णन फ़ंक्शन I (q, t) के समय में फूरियर ट्रांसफॉर्म है, जिसे Eq (2) द्वारा दिखाए गए वैन होव सहसंबंध फ़ंक्शन के स्थान में फूरियर ट्रांसफॉर्म के रूप में देखा जा सकता है:

(2)

जहां स्थिति r और समय t¹³ पर एक परमाणु को खोजने की संभाव्यता घनत्व है।

एक फिकियन प्रसार प्रक्रिया के लिए, स्व-प्रसार फ़ंक्शन का परिणाम (Eq (3)) एक प्रकीर्णन फ़ंक्शन में डबल फूरियर ट्रांसफॉर्म के बाद होता है जिसमें γ = Dq² द्वारा दी गई लाइन चौड़ाई का लोरेंत्ज़ियन होता है।

(3)

अधिक परिष्कृत मॉडल विकसित किए गए और उपयोगी पाए गए जैसे कि पीएस-एनएस आंतरिक प्रोटीन गतिशीलता¹⁴ के लिए सिंगवी और स्जोलैंडर द्वारा कूद प्रसार मॉडल या हाइड्रेशन पानी^15,16,17 के लिए सियर्स द्वारा रोटेशन मॉडल।

आईएल, ग्रेनोबल, फ्रांस (पूरक चित्रा एस 1) में न्यूट्रॉन बैकस्कैटरिंग (एनबीएस) उपकरण आईएन 16 बी^8,9 पर, आमतौर पर प्रोटीन के साथ उपयोग किए जाने वाले सेटअप में आने वाली तरंग दैर्ध्य (पूरक चित्रा एस 2 ए) को ट्यून करने के लिए डॉपलर ड्राइव के साथ विश्लेषक के लिए एसआई 111 क्रिस्टल होते हैं^, जिससे गति हस्तांतरण सीमा ~ 0.2 A-1 < q < ~ 2 ^A-1 और ^–30 μeV की ऊर्जा हस्तांतरण सीमा तक पहुंच मिलती है< < 30 μeV- कुछ ps से लेकर कुछ ns तक के टाइमस्केल और कुछ A की दूरी के अनुरूप है। इसके अलावा, IN16B लोचदार और इनलेस्टिक फिक्स्ड-विंडो स्कैन (E / IFWS) ¹⁰ करने की संभावना प्रदान करता है, जिसमें एक निश्चित ऊर्जा हस्तांतरण पर डेटा अधिग्रहण शामिल है। चूंकि न्यूट्रॉन के साथ काम करते समय फ्लक्स सीमित होता है, इसलिए ई / आईएफडब्ल्यूएस एक ऊर्जा हस्तांतरण के लिए प्रवाह को अधिकतम करने की अनुमति देता है, इस प्रकार संतोषजनक सिग्नल-टू-शोर अनुपात प्राप्त करने के लिए आवश्यक अधिग्रहण समय को कम करता है। एक और हालिया विकल्प बैकस्कैटरिंग और टाइम-ऑफ-फ्लाइट स्पेक्ट्रोमीटर (बीएटीएस) मोड¹¹ है, जो डॉपलर ड्राइव की तुलना में उच्च प्रवाह के साथ ऊर्जा हस्तांतरण की एक विस्तृत श्रृंखला (जैसे, -150 μeV < < 150 μeV) के माप की अनुमति देता है, फिर भी कम ऊर्जा रिज़ॉल्यूशन (पूरक चित्रा S2B) की लागत पर।

न्यूट्रॉन प्रकीर्णन का एक महत्वपूर्ण गुण यह है कि_इंक σ असंगत क्रॉस सेक्शन में ड्यूटेरियम की तुलना में हाइड्रोजन के लिए 40 गुना अधिक मूल्य होता है और आमतौर पर जैविक नमूनों में पाए जाने वाले अन्य तत्वों के लिए नगण्य होता है। इसलिए, एक तरल वातावरण में प्रोटीन की गतिशीलता का अध्ययन ड्यूरेटेड बफर का उपयोग करके किया जा सकता है, और पाउडर अवस्था डी 2 ओ के साथ हाइड्रेटेड हाइड्रोजनीकृत प्रोटीन पाउडर के साथ प्रोटीन आंतरिक गतिशीलता के अध्ययनकी अनुमति देती है, या एच₂ओ के साथ हाइड्रेटेड प्रोटीन पाउडर के लिए हाइड्रेशन पानी का अध्ययन करती है। तरल अवस्था में, न्यूट्रॉन बैकस्कैटरिंग आमतौर पर प्रोटीन (फिकियन-प्रकार प्रसार) और उनकी आंतरिक गतिशीलता के केंद्र-द्रव्यमान आत्म-प्रसार तक पहुंचने की अनुमति देता है। उत्तरार्द्ध रीढ़ की हड्डी और साइड-चेन गतियां हैं जिन्हें आमतौर पर तथाकथित कूद प्रसार मॉडल या अन्य ^3,18 द्वारा वर्णित किया जाता है। हाइड्रोजनीकृत प्रोटीन पाउडर में, प्रोटीन प्रसार अनुपस्थित है और केवल आंतरिक गतिशीलता को मॉडलिंग करने की आवश्यकता है। हाइड्रेशन पानी के लिए, पानी के अणुओं के ट्रांसलेशनल और घूर्णी गति का योगदान गति हस्तांतरण क्यू पर एक अलग निर्भरता प्रस्तुत करता है, जो डेटा विश्लेषण प्रक्रिया¹⁷ में उनके भेद की अनुमति देता है।

यह पेपर न्यूट्रॉन बैकस्कैटरिंग विधि को प्रोटीन के अध्ययन के साथ दिखाता है जो β-स्ट्रैंड के ढेर से युक्त एक कैननिकल रूप में एकत्रित होते हैं- तथाकथित क्रॉस-β पैटर्न^19,20– और लम्बी फाइबर बनाते हैं। यह तथाकथित अमाइलॉइड एकत्रीकरण है, जिसका अल्जाइमर या पार्किंसंस रोग^21,22 जैसे न्यूरोडीजेनेरेटिव विकारों में इसकी केंद्रीय भूमिका के कारण बड़े पैमाने पर अध्ययन किया जाता है। अमाइलॉइड प्रोटीन का अध्ययन उस कार्यात्मक भूमिका से भी प्रेरित है जो वे ^23,24 या उपन्यास बायोमैटेरियल्स²⁵ के विकास के लिए उनकी उच्च क्षमता निभा सकते हैं। अमाइलॉइड एकत्रीकरण के भौतिक रासायनिक निर्धारक अस्पष्ट रहते हैं, और पिछले वर्षों^21,26 के दौरान जबरदस्त प्रगति के बावजूद अमाइलॉइड एकत्रीकरण का कोई सामान्य सिद्धांत उपलब्ध नहीं है।

अमाइलॉइड एकत्रीकरण का तात्पर्य समय के साथ प्रोटीन संरचना और स्थिरता में परिवर्तन से है, जिसका अध्ययन स्वाभाविक रूप से गतिशीलता का तात्पर्य है, जो प्रोटीन रचना स्थिरता, प्रोटीन फ़ंक्शन और प्रोटीन ऊर्जा परिदृश्य²⁷ से जुड़ा हुआ है। डायनामिक्स को सबसे तेज गति²⁸ के लिए एंट्रोपिक योगदान के माध्यम से एक विशिष्ट राज्य की स्थिरता से सीधे जोड़ा जाता है, और प्रोटीन फ़ंक्शन को डोमेन गतियों के लिए प्रकाश-संवेदनशील प्रोटीन²⁹ से एमएस के लिए उप-पीएस से विभिन्न टाइमस्केल पर गति द्वारा बनाए रखा जा सकता है, जिसे पिकोसेकंड-नैनोसेकंड डायनामिक्स³⁰ द्वारा सुविधाजनक बनाया जा सकता है।

अमाइलॉइड प्रोटीन का अध्ययन करने के लिए न्यूट्रॉन बैकस्कैटरिंग स्पेक्ट्रोस्कोपी का उपयोग करने के दो उदाहरण प्रस्तुत किए जाएंगे, एक प्रोटीन गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए तरल अवस्था में और एक हाइड्रेशन पानी की गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए हाइड्रेटेड पाउडर अवस्था में। पहला उदाहरण लाइसोजाइम के एकत्रीकरण को μm आकार के गोले (जिसे कण कहा जाता है) में वास्तविक समय⁵ में पालन किया जाता है, और दूसरा मानव प्रोटीन ताऊ³¹ के देशी और समेकित राज्यों में पानी की गतिशीलता की तुलना से संबंधित है।

लाइसोजाइम प्रतिरक्षा रक्षा में शामिल एक एंजाइम है और 129 अमीनो एसिड अवशेषों से बना है। लाइसोजाइम 10.5 के पीएच पर और 90 डिग्री सेल्सियस के तापमान पर ड्यूरेटेड बफर में कण बना सकता है। न्यूट्रॉन प्रकीर्णन के साथ, हमने दिखाया कि लाइसोजाइम के केंद्र-द्रव्यमान प्रसार गुणांक का समय विकास थियोफ्लेविन टी फ्लोरेसेंस (एक फ्लोरोसेंट जांच जिसका उपयोग एमिलॉयड क्रॉस-β पैटर्न³² के गठन की निगरानी के लिए किया जाता है) के एकल घातीय कैनेटीक्स का अनुसरण करता है, यह दर्शाता है कि गठन कण सुपरस्ट्रक्चर और क्रॉस-β पैटर्न एक ही दर के साथ एक ही चरण में होते हैं। इसके अलावा, एकत्रीकरण प्रक्रिया के दौरान आंतरिक गतिशीलता स्थिर रही, जिसे या तो एक तेजी से संवहन परिवर्तन द्वारा समझाया जा सकता है जिसे एनबीएस उपकरणों पर नहीं देखा जा सकता है, या एकत्रीकरण पर प्रोटीन आंतरिक ऊर्जा में महत्वपूर्ण परिवर्तन की अनुपस्थिति से।

मानव प्रोटीन ताऊ एक आंतरिक रूप से अव्यवस्थित प्रोटीन (आईडीपी) है जिसमें तथाकथित 2 एन 4 आर आइसोफॉर्म के लिए 441 अमीनो एसिड शामिल हैं, जो विशेष रूप से अल्जाइमर रोग³³ में शामिल है। पर्ड्यूरेटेड प्रोटीन ताऊ के पाउडर पर न्यूट्रॉन बैकस्कैटरिंग का उपयोग करते हुए, हमने दिखाया कि फाइबर अवस्था में हाइड्रेशन पानी की गतिशीलता बढ़ जाती है, जिसमें ट्रांसलेशनल गति से गुजरने वाले पानी के अणुओं की उच्च आबादी होती है। परिणाम बताते हैं कि हाइड्रेशन वाटर एन्ट्रॉपी में वृद्धि ताऊ के एमिलॉयड फाइब्रिलेशन को चला सकती है।

Protocol

1. तरल अवस्था में प्रोटीन के लिए ड्यूरेटेड बफर तैयार करें शुद्ध डी2ओ में बफर के सभी घटकों को घोलें। यदि पीएच इलेक्ट्रोड को एच2ओ में कैलिब्रेट किया गया था, तो एनएओडी या डीसीएल34<…

Representative Results

कणों में लाइसोजाइम का एकत्रीकरण 90 डिग्री सेल्सियस पर किया गया था, जिसमें 50 मिलीग्राम / एमएल की प्रोटीन एकाग्रता एक ड्यूरेटेड बफर (पीएच 10.5 पर 0.1 एम एनएसीएल) थी। कणों का गठन 90 डिग्री सेल्सियस तक तापमान वृद्धि…

Discussion

न्यूट्रॉन स्पेक्ट्रोस्कोपी एकमात्र विधि है जो प्रोटीन के आकार या समाधान की जटिलता की परवाह किए बिना प्रोटीन नमूनों के पहनावा-औसत पीएस-एनएस गतिशीलता की जांच करने की अनुमति देती^है। विशेष रूप ?…

Materials

Aluminum sample holder			Not commercially available. Either the local contact on the instrument can provide them or they can be manufactured based on a technical drawing that can be provided by the local contact.
Deuterium chloride, 35 wt. % in D2O, ≥99 atom % D	Sigma-Aldrich	543047
Deuterium oxide (D, 99.9%)	Eurisotop	DLM-4DR-PK
Dow Corning high-vacuum silicone grease	Sigma-Aldrich	Z273554-1EA
Ethanol 96%, EMSURE Reag. Ph Eur	Sigma-Aldrich	1.5901
Glass dessicator	VWR	75871-660
Glass dessicator plate, 140 mm	VWR	89038-068
Indium wire, 1.0 mm (0.04 in) dia, Puratronic, 99.999%	Alfa Aesar	00470.G1
Lysozyme from chicken egg white dialyzed, lyophilized, powder, ~100,000 U/mg	Sigma-Aldrich	62970
nPDyn		v3.x	see github.com/kpounot/nPDyn, model functions fot fitting also included in the software
OHAUS AX324 Adventurer balance, internal calibration	Dutscher	92641
Phosphorus pentoxide, ReagentPlus, 99%	Sigma-Aldrich	214701
Pipette ErgoOne 0.5-10 μL	Starlab	S7100-0510
Pipette ErgoOne 100-1,000 μL	Starlab	S7100-1000
Pipette ErgoOne 20-200 μL	Starlab	S7100-2200
Pipette tip TipOne 1,000 μL	Starlab	S1111-6001
Pipette tip TipOne 10 μL	Starlab	S1111-3200
Pipette tip TipOne 200 μL	Starlab	S1111-0206
Sodium deuteroxide solution, 40 wt. % in D2O, 99.5 atom % D	Sigma-Aldrich	372072